内容提要
本文提出了一种通过邻位/间位/对苯基二硫醇共价连接的二聚七甲基菁(Cy7)分子的策略设计。这些设计促进了纳米颗粒在水中的自发组装，归因于有效的分子间聚集，增强了体内递送。此外，分子内Cy7单元之间的聚集使元二聚体的光热转换效率(PCE)达到74.1%。对二聚体变体不仅达到61.1%的高PCE，而且表现出最有效的药代动力学特征，从而在体内产生无与伦比的抗癌效果。这种双重聚集策略，利用分子间和分子内动力学，使二聚体Cy7具有优越的自我递送和光热功效，为下一代光热疗法提供了一种有前途的方法。
实验结果与讨论
单体和二聚体Cy7合物的表征
在成功合成了Cy7的单体和二聚体形式(包括正二聚体、元二聚体和对二聚体)后，我们初步研究了Cy7在水中分散时的单体和二聚体行为。在水中稀释后，单体Cy7在5分钟内迅速形成大量沉淀。与之形成鲜明对比的是，二聚体Cy7在水相中没有析出。采用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜对水分散二聚体Cy7进行了进一步表征。该尺寸在4°C下保持稳定一周。为了模拟生理环境，我们在含有10%胎牛血清(FBS)的细胞培养基中评估了这些药物在37°C下的稳定性。在这些(TEM)下，结果显示，在平均直径条件下，二聚体Cy7自发组装成球形结构，Cy7-二聚体纳米颗粒保持其尺寸长达24小时。为了更好地复制体内血液循环的条件，我们建立了一个更复杂的实验环境。这包括在37°C的恒定温度下，在100 rpm的稳定搅拌下，保持pH 7.4 PBS和20%血浆的溶液。在这种环境下，二聚体Cy7组装体的稳定性与其在苯基环上的取代位置之间出现了显著的相关性。与间二聚体和邻位二聚体相比，对二聚体的稳定性更好。这一发现表明，对二聚体在静脉给药后可能在体内表现出不同的循环行为，这是其治疗效果的关键因素。
光物理性质
这些化合物分散在添加20% DMF的水中。Cy7单体、邻二聚体、元二聚体和对二聚体的最大吸收峰分别位于近红外区780、790、724和730 nm处。根据朗伯-比尔定律计算它们在最大吸收波长处的摩尔消光系数。值得注意的是二聚体染料在600 ~ 780 nm之间表现出明显的肩峰，表明分子内h聚集体的形成。激发后，Cy7单体在808 nm处显示出明显的荧光峰(荧光量子产率Φf = 4.4%)。相比之下，二聚体Cy7的荧光几乎完全猝灭(Φf <0.3%)。我们还使用DPBF作为指标量化了这些Cy7变体的ROS产生。DPBF在415 nm处的吸光度随着与ROS的反应而减弱。单独的DPBF在760 nm的照射下表现出很强的光稳定性。相比之下，与单体和二聚体Cy7孵育的DPBF在辐照期间吸光度下降的速度相似，可以忽略不计，这表明ROS产量最小。这表明二聚体Cy7荧光猝灭的主要机制是通过非辐射衰变(即产热)。然后，通过监测760 nm辐照下的温度变化(ΔT)来评估它们的光热性能。为了进行比较，采用吲哚菁绿(ICG)作为对照，这是一种经美国食品和药物管理局(FDA)批准的近红外i区荧光染料，ΔT以剂量和功率依赖的方式变化。与单体Cy7和ICG相比，二聚体Cy7表现出明显更高的光热治疗(PTT)效率。在浓度为10 μM(相当于Cy7)，激光功率为300 mW cm−2 (760 nm)时，计算了ΔT和光热转换效率(PCE)。此外，ICG和Cy7单体在780 nm处的吸光度在5分钟内急剧下降，而二聚体Cy7在其最大吸收波长处保持相对较高的吸光度(间二聚体>对二聚体>对二聚体)，表明二聚后光稳定性增强。此外，在五个加热和冷却循环中，二聚体Cy7比ICG和单体Cy7表现出更稳定的温度变化，进一步证实了它们改善的光稳定性。
细胞内吞和光热治疗研究
为了评估二聚体Cy7的细胞摄取效率，香豆素6 (C6)被包封作为荧光标记物。细胞样品单独暴露于C6、C6/Cy7单体组合和C6标记的二聚体Cy7组件，在孵育1小时和4小时后，细胞内荧光强度随时间增加。值得注意的是，4 h和8 h时细胞对Cy7单体和二聚体的摄取无显著差异(p > 0.05)。因此，确定4 h为下一个细胞实验的最佳孵育时间。单体Cy7没有显著改变游离C6的摄取。另一方面，用C6标记的二聚体Cy7组件处理的细胞在4T1细胞中的荧光强度明显增强。进一步的观察显示，在细胞培养条件下，具有荧光标记的邻二聚体、间二聚体和对二聚体的荧光特性几乎无法区分，这表明这些二聚体Cy7的细胞摄取效率相当。
研究了Cy7单体和二聚体对4T1细胞系的光疗作用。在黑暗条件下，Cy7-单体在20 × 10−6 m处理时，4T1细胞的细胞活力下降到60%，而在10 × 10−6 m处理时，Cy7-二聚体的细胞毒性可以忽略不计，表明二聚后的生物相容性良好。用Cy7单体和二聚体孵育的3T3细胞也得到了这个结果。在照射5min (760 nm, 300 mW cm−2)后，由于cy7 -二聚体具有更好的热效应，其光毒性在不同程度上强于单体。IC50值列于表S2(支持信息)中，排序如下:元二聚体(0.406 × 10−9 m) <对二聚体(0.772 × 10−9 m) <正位二聚体(1.337 × 10−9 m) < Cy7单体(4.098 × 10−9 m)。此外，通过活/死染色实验直观评价Cy7二聚体的细胞杀伤效果。这些实验包括用钙黄蛋白AM(绿色)染色活细胞和用碘化丙啶(PI，红色)染色死细胞。IC50值较低的配方显示出较大的红色荧光区域，表明细胞死亡率增加。值得注意的是，几乎所有使用元二聚体治疗的4T1细胞都在放疗后死亡，这强调了这些特定二聚体组合的有效光疗能力。
药物动力学行为
静脉给药是临床肿瘤治疗中广泛采用的给药方法。这一途径确保了药物的即时和完全的全身生物利用度。一般来说，血液中较高的药物浓度有利于实现肿瘤区域浓度的升高，从而增强抗癌效果。因此，我们使用香豆素6 (C6)作为荧光标记，研究了单体Cy7和二聚体Cy7的药代动力学。选取雄性Sprague-Dawley大鼠25只(180 ~ 220 g)，随机分为5组(n = 5)，分别给药C6、C6 / cy7单体混合物和C6标记cy7二聚体。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 h，采用肝素化留置针采集血样。在13000 rpm的转速下离心10分钟，将血浆从这些样品中分离出来进行分析。所得的血浆浓度-时间曲线如图。数据显示，C6能迅速从血液中清除，而C6/ Cy7单体组合显示出与C6单体相似的药代动力学特征，表明Cy7单体在水环境中组装不良。相比之下，当C6被装载到二聚体Cy7组件中时，血浆浓度显著增加，表明二聚体Cy7组件的体内循环增强。此外，这些二聚体的特定构象极大地影响了它们的药代动力学行为。循环功效排序为:对二聚体>元二聚体>邻二聚体。这一排名与在模拟体内循环条件下观察到的二聚体Cy7的稳定性一致。
肿瘤积累与光热效率
利用二聚体Cy7组件显著的光热效应，光声成像(PAI)被用于监测它们在体内的肿瘤积累。与荧光成像相比，PAI具有更好的分辨率、对比度和组织穿透性，特别是在更深的深度和高散射介质中。在PAI过程中，光能转化为热能，在周围环境中引起热弹性膨胀，并发射超声信号进行成像重建。基于这一机制，光热剂(PTA)的光热转换效率(PCE)对光声成像质量起着至关重要的作用。如图所示，单聚体和二聚体Cy7在光声强度和染料浓度之间表现出正线性关系。在相同浓度下，光声强度依次为元二聚体>对二聚体>正二聚体>单体Cy7，与其各自的PCE排名一致。给药后，单体Cy7在肿瘤部位的光声信号在2至24小时内减弱，表明肿瘤积聚不理想。相比之下，二聚体Cy7组装体在肿瘤内表现出明显更强的光声信号，这可归因于其改善的药代动力学行为和增强的渗透性和滞留性(EPR)效应。注射后12小时观察到二聚体Cy7组装体的光声信号峰值，表明该时间点肿瘤中的浓度积累最高。因此，这个时间被确定为应用外部照射以最大化体内光热效应的最佳时间。有趣的是，尽管对二聚体具有第二高的PCE，但它们在肿瘤组织中表现出最强的光声强度。这可能与其优越的体内循环能力有关，从而导致最高的肿瘤蓄积。结果，对二聚体处理的小鼠的升温速率(PCE = 61.2%，ΔT≈20°C)比元二聚体处理的小鼠(PCE = 74.1%， ΔT≈15°C)最快。
体内抗肿瘤效率
对治疗的体内抗肿瘤效果进行了严格的评估。单独接受PBS治疗的组肿瘤生长迅速，到第14天达到约1100 mm3的体积。在PBS加照射组和未加激光照射的Cy7单体和二聚体组中观察到类似的生长模式，与仅PBS组相似。然而，当照射时，单体Cy7组表现出部分抑制肿瘤生长，尽管体积仍然显著增加。与此形成鲜明对比的是，用二聚体Cy7组装体照射的组显示出明显的肿瘤生长抑制。这种效果可归因于它们更高的热效率和增强的体内自我递送能力。
值得注意的是，对二聚体组合显示出最显著的抗肿瘤活性，几乎没有增加肿瘤体积。这种优越的疗效可能是由于与其他二聚体Cy7相比，对二聚体组件的药代动力学行为增强。例如，在每个测量间隔内，对二聚体的血浆浓度始终超过元二聚体的血浆浓度。因此，一定体积的血液可以运输更多的对二聚体到肿瘤，导致更高的积累，从而产生更有效的体内光疗效果。
通过提取的肿瘤组织的组织学和增殖研究，进一步验证了对二聚体的特殊抗肿瘤效率。苏木精和伊红(H&E)染色显示肿瘤切片的核碎裂和坏死组织比例很高，特别是在参数组合处理组。此外，Ki67荧光分析显示，这些小鼠的肿瘤增殖明显减少，绿色荧光信号最弱。此外，通过监测小鼠的体重、血液学参数和主要组织的组织学变化来评估各种配方的生物相容性。用二聚体Cy7组件处理的组在这些参数上没有显着偏差，表明可接受的生物安全性和耐受性。
总结
总之，本研究介绍了一种有前途的二聚体设计策略，用于开发高性能近红外光热剂(PTAs)。通过将两个Cy7分子与邻位/间位/对苯基二硫醇连接，我们合成了具有优异纳米组装和热效应的二聚体化合物。值得注意的是，这些二聚体中单体之间的光致电子转移显著促进了非辐射衰变，导致热量产生显著增加。这些二聚体的光热转化效率(PCE)顺序为:间二聚体>对二聚体>邻二聚体，单体Cy7排在后面。对二聚体脱颖而出，表现出最有利的组装稳定性和药代动力学特征，显示出最高的体内抗癌功效。这项研究对光热剂(PTA)的发展做出了重要贡献，突出了分子内和分子间协同聚集在产生强效治疗剂方面的功效，并为治疗突破开辟了新的途径。
参考文献
Synergistic Inter- and Intramolecular Aggregation of Dimeric Cyanine Dyes Affords Highly Efficient In Vivo Self-Delivery and Photothermal Therapy ，Yanxian Hou, Jianwei Li, Guanyu Jiang, Tianping Xia, Zipeng Li, Hua Gu, Xiaogang Liu,* Qichao Yao, Changyu Zhang, Wenkai Liu, Jianjun Du, Wen Sun, Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng，Adv. Funct. Mater. 2024, 2316452，https://doi.org/10.1002/adfm.202316452
