内容提要
近红外二区(NIR-II)治疗由于增强的组织穿透性和更高的最大允许曝光量，为精确疾病光治疗提供了新的机会。缺乏有效的NIR-II吸收和不可控的激发态能量衰减途径的传统方案往往导致治疗效果不足。本文报道了一种基于azulenyl squaraine衍生物的光治疗纳米剂(PS-1 NPs)，具有以1092 nm为中心的强NIR-II吸收带，使几乎所有吸收的激发能通过非辐射衰变途径消散，从而实现了高光热转换效率(90.98%)和光声响应。体外和体内光声/光热治疗结果均表明PS-1 NPs具有增强的深部组织肿瘤治疗性能。即使在5 mm深部肿瘤模型中，PS-1 NPs在光声成像引导下的光热治疗中也表现出令人满意的抗肿瘤效果。对于人类拔牙根管感染模型，PS-1 NPs与0.5% NaClO溶液的光热效应协同效果与临床金标准冲洗剂5.25% NaClO的治疗效果相当，为NIR-II治疗药物在口腔医学中的扩展开辟了可能性。
实验结果与讨论
芳酸染料的设计与合成
我们设计并合成了两种azulenyl PHAs的方酸染料（PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2）。两种稠合的azulenyl squaines是共轭骨架的异构体，保证了主吸收波段出现在近红外区域。Azulene单元作为共轭部分，通过红移吸收和诱导荧光猝灭来控制激发态能量通过非辐射衰变途径的耗散。Azulene单元的π-融合修饰进一步使吸收带红移，并通过调整稠合位点对分子的平面度进行微调。PFAz-SQ-1与吡咯的融合发生在azulene的五元环上，而PFAz-SQ-2与吡咯的融合发生在azulene的七元环上，方酸与azulene的五元环相连。PFAz-SQ-1由于更大的位阻，会比PFAz-SQ-2表现出更扭曲的构象，有利于j聚集的滑移堆积。另一方面，我们首先合成了十二烷基链修饰的PFAz-SQ-2类似物，发现它的分子骨架更平面，使分子更容易聚集，因此不溶于普通有机溶剂。因此，我们合成了己基癸基烷基链安装衍生物PFAz-SQ-2，以提高其溶解度。
芳酸染料的光物理性质和量化计算
我们利用密度泛函理论(DFT)计算了优化后的结构和电子性质，PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2表现出不同的基态几何形状。PFAz-SQ-2呈几乎平面的主链结构，而PFAz-SQ-1呈扭曲结构，两个azulene单元之间的二面角约为32°。PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2的扭转矩差异意味着它们在聚集状态下可能采用不同的堆叠模式(如h聚集和j聚集)。两种化合物的HOMO和LUMO分布相似，电子密度更集中在中心的方阵单元和叠氮单元。然而，与pfaz - sq -2 (Eg=1.93 eV)相比，PFAz-SQ-1表现出更低的HOMO - LUMO能隙(Eg=1.72 eV)。PFAz-SQ-1的能隙减小表明在近红外区吸收带有较大红移的潜力。我们根据两种分子的优化结构进行垂直激发计算，得到模拟吸收光谱。与化合物PFAz-SQ-2相比，PFAz-SQ-1在最大吸收波长处出现了红移，这与他们的HOMO-LUMO能隙结果一致。PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2在四氢呋喃(THF)溶液中的紫外/可见/近红外吸收光谱如图1e所示。PFAz-SQ-1的最大吸收波长(λmax)位于860 nm处，与Az-SQ-1相比呈现出100 nm的色移。类似地，PFAz-SQ-2的λmax以820 nm为中心，与Az-SQ-1相比，红移为60 nm。在较低PBS含量(10% ~ 50%)下，PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2的吸收光谱与在纯THF中观察到的相似。然而，当PBS含量超过60%时，吸收光谱发生了明显变化，表明两分子在混合溶液中逐渐形成聚集体。当浓度低于10 μM时，PFAz-SQ-1的吸光度主要在860 nm处达到峰值，与纯THF的吸光度曲线非常接近。然而，当浓度增加到20 μM及以上时，在980 nm处出现了额外的吸收肩峰。随着PFAz-SQ-1在混合溶剂中的浓度增加，在860 nm处吸光度逐渐降低，而在980 nm处吸光度增强。最终，在50 μM的浓度下，两个峰合并为一个宽的红移吸收峰。在纯THF中，860nm处的单吸收峰对应于自由态PFAz-SQ-1。在THF/ PBS混合溶剂中，随着PFAz-SQ-1浓度的升高，初级吸收峰(980 nm)的优势度增加，这主要是由于不良溶剂(PBS)的影响促进了PFAz-SQ-1 J聚集体的形成。
芳酸纳米粒子的制备
这三种化合物在有机溶剂中都表现出可以忽略不计的荧光，证实荧光猝灭是由于引入了azulene单元。为了证实PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2通过非辐射衰变以外的途径表现出最小的能量耗散，我们选择了商用吲哚菁绿(ICG)作为参考。以2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)为一般ROS和单线态氧指标，分别评价PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2的ROS生成能力。数据显示PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2的ROS生成能力可以忽略不计，而ICG的ROS生成能力显著。为了进一步研究PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2聚集体的光物理性质，采用FDA批准的两亲性表面活性剂F127作为包封基质。采用纳米沉淀法将这两种分子包封成纳米粒子(分别命名为PS-1 NPs和PS-2 NPs)。动态光散射显示，PS-1 NPs和PS-2 NPs的平均直径相似(- 120 nm)，多分散性指数(PDI)分别为0.372和0.406，表明PS-1 NPs和PS-2 NPs的粒径分布相对均匀。透射电子显微镜(TEM)图像进一步证实了它们的球形形态和相似的尺寸。此外，在4°C的水中或在含有10%胎牛血清的室温水中储存一周后，这些纳米颗粒未观察到明显的聚集，表明它们具有出色的尺寸稳定性。zeta电位结果表明，PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2具有相当的表面电位。因此，PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2在光物理性质上的任何差异都应完全归因于它们的分子结构和聚集模式。PS-1在水中的最大吸收波长(λmax)为1092 nm。与有机溶剂中的光谱相比，232 nm的红移表明j聚集。PS-2 NPs的吸收光谱在650 nm处有一个中心峰和几个肩峰。这种显著的色移代表了h -聚集体在水中的形成。纳米颗粒内部不同的聚集模式可归因于其单分子态的构象差异。在聚集态下，PFAz-SQ-1的发色团倾向于滑移堆叠排列，形成j聚集体。另一方面，PFAz-SQ-2的几何结构更趋于平面化，π轨道有很强的重叠，倾向于采用“面对面”的堆叠方式，从而形成h聚集体。进一步评价了PS-1 NPs和PS-2 NPs的荧光性能和ROS生成能力。此外，与ICG相比，PS-1 NPs和PS-2 NPs表现出最小的ROS生成能力。所有这些发现进一步验证了我们的方法在抑制激发态能量流向非辐射衰变途径方面的有效性，通过整合azulenyl pha和squarines实现。
芳酸纳米粒子的光热性质研究
我们在NIR I和NIR ii窗口中比较了PS-1 NPs和PS-2 NPs的光热性能。用热成像仪记录热图像和温度变化曲线。在确定了不同波长(1064 nm或808 nm)和功率密度(1.0 W cm-2或0.33 W cm-2)的辐照条件下，PS-1纳米颗粒的光热性能优于PS-2纳米颗粒后，我们根据各自MPE辐照条件下的稳态最高温度和冷却速率进一步计算了这些纳米颗粒的PCE值。在1064 nm激光照射下，PS-1 NPs的PCE值为90.98%，而在808 nm激光照射下，PS-2 NPs的PCE值为80.58%。高浓度的PS-1 NPs和PS-2 NPs导致更快的升温速率和更高的稳态溶液温度。在MPE功率密度为1064 nm (1.0 W cm 2)时，在30 μM PS-1 NPs溶液中观察到的最高温度为96.6℃。然而，由于MPE功率密度较低，为808 nm (0.33 W cm-2)， 30 μM的PS2 NPs溶液在激光照射3分钟后仅达到52.9℃的稳态温度。并记录了不同功率密度下PS-1 NPs和PS-2 NPs溶液(30 μM)的升温曲线。结果表明，随着激光辐照功率密度的增大，纳米粒子的升温速率和稳态温度均相应增大。例如，在30 μM和1.0 W cm-2的功率密度条件下，PS-1 NPs和PS-2 NPs在1064 nm和808 nm激光照射下的稳态温度分别为96.6℃和94.1℃。值得注意的是，尽管PS-1 NPs和PS-2 NPs都表现出了出色的光热转换性能，但PS-1 NPs由于在NIR-II区允许更高MPE功率密度的激光照射，获得了更高的稳态温度，这使得PS-1 NPs在深部组织PTT应用中的进一步探索前景广阔。
芳酸纳米粒子的光声性质研究
在NIR-II激光照射下，PS-1 NPs具有在组织深部区域产生强光声信号的潜力。PS-1 NPs和PS-2 NPs的光谱在700 ~ 1064 nm范围内采集，与相应的吸收光谱有很好的一致性。具有代表性的体外PA图像和定量分析显示，PS-1和PS-2 NPs的PA响应强度随着纳米颗粒溶液浓度的增加而增加。此外，比较分析表明，在相同浓度下，PS-1 NPs比PS-2 NPs表现出更强的PA反应。这种差异可以归因于更高的辐射功率剂量由1064nm激光启用。为了探索这两种纳米颗粒在深层组织中的PA响应能力，我们将不同厚度(5、10、15 mm)的鸡胸组织样品覆盖成模型。代表性的PA图像和定量分析表明，在不同深度，PS-1 NPs比PS-2 NPs产生更强的PA信号。值得注意的是，即使深度超过10 mm，仍然可以检测到稳健的PA信号，尽管两种纳米颗粒的信号都随着组织厚度的增加而呈指数衰减。在4T1乳腺荷瘤小鼠模型上进行实验，评价PA在体内成像的应用价值。静脉注射PS-1 NPs和PS-2 NPs (200 μL, 1.5 mM)后，利用PA成像系统监测体内PA信号。肿瘤区域的PA信号在最初2小时内较弱，但随着时间的推移逐渐增强。注射后12小时，由于增强的渗透性和滞留性(EPR)效应，信号与背景比(S/B)为7.7，可以清晰地描绘肿瘤部位。注射后12 ~ 36小时PA信号逐渐下降。定量数据显示，注射后12小时，肿瘤内PA信号达到最大值。值得注意的是，PS-2 NPs的体内PA信号变化与PS-1 NPs非常相似，这是由于它们的大小和形态相似。注射后12小时的时间点是各种体内应用(如PA图像引导光热治疗)的最佳时间点。为了进一步验证PS-1 NPs在深部组织的体内PA成像能力，在荷瘤小鼠体内静脉注射PS-1 NPs和PS-2 NPs 12小时后，用5 mm的鸡胸组织覆盖肿瘤部位进行PA成像。值得注意的是，与PS-2 NPs相比，PS-1 NPs表现出更好的肿瘤部位可视化。定量分析显示，PS-1 NPs肿瘤部位的总PA信号强度是PS-2 NPs的2.7倍。这些结果有力地证明了PS-1 NPs作为NIR-II PA造影剂用于深部肿瘤PA成像的潜力。
芳酸纳米粒子的光热治疗研究
基于PS-1 NPs令人鼓舞的深层光热性能和PA成像能力，我们进一步研究了PS-1 NPs在体内深部肿瘤PA图像引导光热治疗中的潜力。根据实验组的不同，每组小鼠静脉注射生理盐水或相应的纳米颗粒溶液(200 μL, 1.5 mM)。为了确保深层组织PTT的公平比较，排除了肿瘤部位纳米颗粒积聚的差异。在静脉注射PS-1 NPs和PS-2 NPs 12 h后，根据PA成像结果确定肿瘤位置后，我们将各自的纳米粒子溶液或生理盐水通过肿瘤注射给荷瘤小鼠。随后，在肿瘤上方放置一块5毫米厚的鸡胸组织，以模拟深层肿瘤。我们分别在1064 nm和808 nm的MPE功率密度下进行激光照射。在每个时间点，我们使用热像仪实时记录鸡胸组织裸露时肿瘤部位的温度。定量分析显示，在“PS-1 NPs+1064 nm”组中，激光照射10 min后，肿瘤部位的平均温度可达到65℃左右。这是由于PS-1 NPs在激光照射下具有显著的光热转化，以及1064 nm激光在NIR-II范围内具有优异的组织穿透能力。值得注意的是，MPE功率密度为808 nm的激光照射并没有使肿瘤温度升高到诱导细胞凋亡所需的PTT阈值温度(43°C)以上。此外，在1064 nm激光照射下，“Saline+1064 nm”组肿瘤部位温度达到40℃，而“Saline+808 nm”组肿瘤部位在808 nm激光照射下几乎没有温度变化。这种差异可以归因于水产生的热量，因为水在1064nm处比808nm处具有更高的吸收率，并且1064nm激光允许比808nm更高的功率密度。这些数据证实了PS-1 NPs对深部组织PTT的优越治疗效果，与体外实验结果一致。为了进一步评价PS-1 NPs在深层PA成像引导下的光热抗肿瘤效果，我们在16天的研究期间每隔一天记录各组小鼠的肿瘤体积和体重。只有“PS-1 NPs+1064 nm”组的肿瘤生长被PTT完全抑制。与“生理盐水”组相比，“PS-2 NPs+808 nm”组与其他治疗组的肿瘤生长无显著差异。此外，在七组小鼠中没有观察到明显的体重减轻，再次表明这些治疗没有对身体造成不良影响。这些数据都有力地证明了PS-1 NPs在PA成像引导下深层光热治疗方面的巨大潜力，这得益于其有效的NIR-II光收集能力、优异的光热转换性能，以及NIR-II激光良好的组织穿透能力和高MPE功率密度的协同作用。
芳酸纳米粒子在牙根管感染中的应用
我们选择浓度为30 μM的PS-1 NPs进行进一步疗效评价，并建立离体根管生物膜感染模型。将感染根管随机分为8组:“未经处理”、“生理盐水”、“PS-1 NPs”、“PS-1 NPs+0.5% NaClO”、“L+0.5% NaClO”、“PS-1 NPs+L”、“PS-1 NPs+L+0.5% NaClO”和“5.25% NaClO”组。将生理盐水或PS-1 NPs生理盐水溶液按分组分别注入根管。对于“+ L”组，使用1064 nm激光在距离根管口5 mm处垂直照射180 s。对于“+ 0.5% NaClO”组，在各自的处理程序后进行0.5% NaClO冲洗。不同处理后，用锉刀从根管壁上收集牙本质碎片，悬浮在培养基中，再孵育24小时。“未经处理”、“生理盐水”、“PS-1 NPs”、“PS-1 NPs+0.5% NaClO”、“L+ 0.5% NaClO”对于“PS1 NPs+L”、“PS-1 NPs+L+0.5% NaClO”和金标准“5.25% NaClO”组。激光照射PS-1 NPs和0.5% NaClO冲洗的组合策略可以有效清除细菌。值得注意的是，虽然“PS-1 NPs+0.5% NaClO”和“L+0.5% NaClO”组经过处理后菌落计数减少，但由于温升不足以破坏生物膜和菌斑，抗菌效果并不理想。进一步对细菌存活率进行统计分析，更直观地显示“PS-1 NPs+L”和“PS-1 NPs+L+0.5% NaClO”组对粪肠球菌的根除效果较好，清除率分别为98.4%和99.8%。与临床金标准“5.25% NaClO”相比，细菌存活率无显著差异。为了进一步探讨图7e结果中“PS-1 NPs+L”组和“PS-1 NPs+L+0.5% NaClO”组的差异，并与“5.25% NaClO”组进行更直观的比较，我们进一步沿纵轴对各组离体根管进行切片，并利用扫描电镜(SEM)观察粪肠球菌在根管内的定殖情况。 “未经处理”、“生理盐水”和“PS-1 NPs”组的根管壁表面粗糙，覆盖着大量生物膜形成菌落和斑块，牙本质小管严重堵塞。虽然“PS-1 NPs+0.5% NaClO”组和“L+0.5% NaClO”组处理后细菌负荷显著降低，但仍有相当数量的细菌粘附在牙本质小管内。相比之下，“PS-1 NPs+L+0.5% NaClO”组，与临床金标准“5.25% NaClO”相当，显示出相当程度的细菌根除，根管壁和牙本质小管几乎完全清洁。这些结果共同证明了我们的策略的安全性和有效性，即使用具有高PCE的PS-1 NPs快速加热根管至高温，破坏粘附在根管壁上的生物膜的完整性，然后用低浓度NaClO溶液(0.5%)冲洗以治疗根管细菌感染。
总结
我们提出了构建具有优异光热转换性能和强PA反应的强NIR-II吸收治疗剂的竞争策略。所获得的PFAz-SQ-1和PFAz-SQ-2分子在溶液和纳米粒子状态下均未表现出可检测到的荧光或ROS的产生，表明通过方酸和azulene单元的稠合，激发态能量在非辐射耗散途径上最大程度地集中。通过调整不同的稠合位点，得到两种不同的优化结构，从而在聚合状态下产生不同的聚合模式。由PFAzSQ-1分子更扭曲的构象制备的PS-1 NPs表现出较强的NIR-II吸收，由于j聚集，最大吸收波长红移至1092 nm。基于该策略，得到的PS-1 NPs的理论PCE值接近100%，实际测试的PCE值为90.98%。体外和体内数据均证实PS1 NPs对深部肿瘤模型具有突出的治疗作用。此外，在治疗人类拔牙根管感染时，我们巧妙地提出利用高MPE的NIR-II激光器和高PCE的PS-1 NPs产生瞬时高热，有效破坏附着在复杂根管结构上的生物膜。随后，使用0.5% NaClO溶液冲洗死亡菌落和PS-1 NPs，确保彻底清洁根管。该方法不仅达到了相当于临床金标准(5.25% NaClO)的治疗效果，而且显著降低了NaClO的工作浓度，从而最大限度地降低了过敏等潜在风险。这种治疗根管感染的范例为口腔医学提供了一个非常有前途的替代方案。
参考文献
Fused Azulenyl Squaraine Derivatives Improve Phototheranostics in the Second Near-Infrared Window by Concentrating Excited State Energy on Non-Radiative Decay Pathways， Heqi Gao , Yiming Yao , Cong Li, Jingtian Zhang, Haoyun Yu, Xiaodi Yang, Jing Shen, Qian Liu, Ruitong Xu, Xike Gao,* and Dan Ding*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202400372, https://doi.org/10.1002/anie.202400372
