内容提要
本研究有机纳米探针tH7@CT8，通过荧光团三聚化设计解决小分子试剂光热转换效率限制。[1,2,5]-噻二唑[3,4-g]喹诺啉荧光团衍生物H7的三聚化诱导聚集，使荧光量子产率降至0.11%（单体为0.42%），光热转换效率（PTCE）提升至43.1%。在靶向骨肉瘤的两亲性基质中封装形成72±19 nm的纳米颗粒，肿瘤摄取较非靶向对照增强4倍。在原位骨肉瘤模型中，tH7@CT8实现PAI检测和实时NIR-II引导，肿瘤与背景信号比>12:1，建立了协调肿瘤学中深度分辨率权衡的分子设计策略，推进有机造影剂临床转化。
结果与讨论
tH7的合理设计与合成。共价三聚体tH7通过结构合理化来调节双峰成像应用的关键光物理性质。tq基荧光团H7的三聚化引起吸收/发射光谱的色移，同时放大了非辐射衰变途径，这是增强PTCE的关键。值得注意的是，三聚化将HOMO−LUMO能差(ΔEgap))从1.68eV (H7)降低到1.18 eV (tH7)，超过了基于苯并双硫二唑的NIR-II荧光团的1.50 eV阈值，表明近红外吸收特性增强。tH7的合成是通过从TPA-Br开始的四步路线完成的:(1)溴化三苯胺供体的Miyaura硼化反应生成硼化前体(产率~ 42%)，(2)硼化前体的Suzuki交叉偶联构建π共轭核(产率~ 25%)，(3)锌介导的硝基中间体还原，(4)通过席夫碱生成反应与环己酮三聚，生成最终产物tH7(产率约8%)。光学表征证实了三聚体诱导的光谱调制。在二氯甲烷中，tH7的最大吸光度为864 nm (ε = 1.4 ×10-5M−1cm−1)，NIR-II的荧光发射为1192 nm, Stokes位移为328 nm，足以使体内的激发后向散射干扰最小。在水介质中出现了聚集诱导发射(AIE)行为:相对于纯THF，当水分数为80%时，荧光强度增加了2.9倍(fw))，这是由于三苯胺供体部分的分子内旋转受到限制。
为了使疏水性NIR-II荧光基团tH7在水介质中的生物应用，采用纳米沉淀法将tH7包封在1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[氨基(聚乙二醇)-3.4k](DSPE-PEG3.4k)的两亲性基质中。TEM显示单分散球形纳米颗粒(tH7点)，芯直径为56±15 nm。DLS测量结果表明，该纳米颗粒具有高度单分散的水动力直径为181±44 nm，多分散指数(PDI)为0.06，与聚乙二醇化纳米颗粒结构一致。在水环境中，tH7点在855nm处显示出最大吸光度，NIR-II在1200 nm处显示出最大发射。吸光度(864 nm)与浓度(1 ~ 50 μM)之间的线性相关(R2= 0.998)证实了符合Lambert - Beer定律。包封效率达到72.5±11.4%，通过HPLCUV校准(λ = 864 nm)进行量化。光声表征显示860 nm处的峰值信号强度，与光吸收相关。在相同浓度(100 μM)下，tH7点产生的光声振幅比ICG高3.70倍，在鸡胸肉中实现组织穿透深度bbb9 mm。然而，在NIR-II成像模式下，穿透深度被限制在7mm。这种增强与优越的光热转换效率(43.1%)相关，通过Roper方法21在808 nm照射下(1Wcm−2)确定。实时热像分析显示，在300 μM下，温度在150秒内从23.1°C快速升高到89.7°C。连续近红外照射(808 nm, 1Wcm−2)下的光稳定性评估显示出出色的鲁棒性。tH7点在60分钟内保持了初始荧光强度的88±5%，而ICG为37±6%。静止存放7天后，tH7点的粒径增加了约50%;然而，没有观察到沉淀。在水、PBS (pH 7.4)、DMEM和10% FBS等生理介质中进一步验证了荧光稳定性，强度变化<5%，证实了体内应用的胶体和光学稳定性。功能化、靶向效果和生物相容性评估。为了实现骨肉瘤靶向成像，利用CT-8对tH7点进行功能化，这是一种半胱氨酸修饰的寡肽(CPPSHTPT)，通过马来酰亚胺-硫醇偶联化学方法从噬体显示优化的pt -7,22,23中获得。MALDI-TOF MS证实了DSPE-PEG3.4k-CT8的成功合成，与CT-8添加相对应的质量位移为837.8 Da。掺入30 mol % DSPE-PEG3.4k-CT8注入纳米颗粒基质中产生tH7@CT8个点，其ζ电位升高从−23.3到−19.1 mV，与CT8的理论等电点(pI = 8.2)一致。通过TEM(72±19nm) 和 DLS(223±60 nm, PDI = 0.07) 测 定 ，tH7@CT8圆点的尺寸比tH7圆点大30%左右。这种扩大归因于纳米颗粒表面的肽CT-8涂层。
为了评估结构修饰后CT-8特异性的保存情况，FITC通过6-氨基己酸(Ahx)间隔剂与CT-8共价偶联，得到衍生物FITC-CT-8(化学结构)。通过质谱法证实了FITC-CT-8的成功合成，随后将该化合物用于流式细胞术分析以评估其结合特异性。FITC-CT-8培养的143B细胞在FITC荧光通道中表现出明显的高信号，平均荧光强度(MFI)约为20。这一数值明显高于阴性对照组(MFIs低于8)，包括成骨细胞hFOB 1.19细胞和乳腺癌MCF-7细胞，这两种细胞都缺乏对CT-8的结合亲和力。此外，在CT-8预阻断的143B细胞中，MFI降低到与阴性对照相当的水平，表明有效抑制了结合。同样的结论通过荧光共聚焦显微镜成像得到进一步证实和视觉强化。以上结果验证了CT-8肽对143B细胞的高特异性。通过体外NIR-II荧光成像对143B、hFOB 1.19和MCF-7细胞的靶向性验证tH7@CT8 dots的靶向性。骨肉瘤143B细胞的相对MFI(6.4±1.4)是hFOB 1.19成骨细胞(1.5±0.2)和MCF-7乳腺癌细胞(2.2±0.3，*p < 0.05，方差分析与Tukey后检验)的3倍。与游离CT-8的竞争性结合试验将143B MFI降低至1.6±0.2，证实受体介导的摄取。通过CCK-8试验进行的细胞毒性评估显示，暴露于tH7@CT8 dots(0−50 μgmL−1) 24小时后，143B和NIH/3T3细胞的存活率为bbb90 %。在tH7@CT8点浓度范围从0到100 μM范围内，血液样品的溶血率保持在5%以下，表明血液相容性良好。静脉注射10 μmolkg−1剂量的Balb/c小鼠(n = 3)急性毒性研究显示，h&e染色的脏器(心、肝、脾、肺、肾)。血液学参数在7天内保持在正常范围内，与PBS对照组相比无显著差异，因此表明慢性毒性最小(p > 0.05)。此外，体内药代动力学研究确定tH7@CT8 dots在血液循环中的半衰期为53分钟。
皮下/原位骨肉瘤的体内NIR-II荧光和光声成像
在Balb/c裸鼠皮下移植143B骨肉瘤(n = 3)中评估tH7@CT8纳米颗粒的肿瘤靶向效果和药代动力学特征。静脉注射tH7@CT8纳米颗粒(2.5 μmolkg−1，200 μLPBS)可实现实时NIR-II荧光成像(808 nm激发，0.3Wcm−2;1000 nm LP滤光片，100 ms暴露)。右后肢肿瘤特异性信号早在注射后1小时就可检测到，12小时SBR峰值为9.8±1.)。体外器官成像证实，24小时的信号衰减(SBR = 5.6±0.5)与肝脏清除动力学相关。显示主要的纳米颗粒积聚在肝脏(29±11% ID/g)和脾脏(160±70% ID/g)。
在竞争性抑制研究中，预先给小鼠注射游离CT-8肽(2mg，静脉注射)，在12 h p.i.i时，肿瘤荧光强度降低76% (SBR = 2.4±0.3 vs 9.8±1.4，**p < 0.01，)，证实了受体介导的靶向作用。1 h p.i时残留肿瘤信号(SBR = 3.5±0.2)通过增强渗透性和潴留(EPR)效应与被动积累一致。非靶向tH7点的对照实验显示出可忽略不计的肿瘤滞留，这是由于它们具有更高的负ζ-电位，这加速了调控和网状内皮系统的清除。光声断层扫描证实了这些发现，在10 h p.i.下以150 μm的空间分辨率显示肿瘤血管化模式。作为NIR-II荧光跟踪的补充，在注射前860 nm激发(1.5 MHz换能器)和注射后2、5、10、20和36 h分别对tH7@CT8点(2.5 μmolkg−1)进行纵向PAI检测。肿瘤相关光声信号与NIR-II荧光数据显示出药代动力学一致性，在p.i. 10 h时达到峰值，SBR为20.2±6.2。
结论
本研究构建了先进有机纳米探针tH7@CT8，通过精确分子工程协调光声成像深度分辨率和NIR-II荧光灵敏度。TQ衍生物三聚化通过可控π-π堆叠实现43.1%的光热转换效率，同时保留0.11%的荧光量子产率用于实时引导。靶向CT8的纳米颗粒肿瘤积累较非靶向对照改善4倍，可在0.9 cm深度描绘亚毫米肿瘤边缘，NIR-II肿瘤与背景信号比>12:1，优于现有双模态药物。竞争结合试验证实受体特异性靶向（阻断后摄取减少76%）。未来需将光谱扩展至NIR-IIb（1500-1700 nm）以提升穿透深度，整合微环境响应基序动态绘制肿瘤异质性，为诊断发展提供通用蓝图。
参考文献
Trimerization-Enhanced NIR-II/Photoacoustic Nanoprobes for Precision Osteosarcoma Imaging, SiyuLu, JingWu, ShuxinLyu, YifengYu, JongSeung Kim, Ruiping Zhang,*YulingXiao,* Xuechuan Hong,* XiaodongZeng*, Anal. Chem. ,2025, doi.org/10.1021/acs.analchem.5c05017
