内容提要
本研究报道了一种独特的一锅法、无催化剂的 [2+2] 环加成-逆电环化 [4+2] 氰基 - 狄尔斯 - 阿尔德反应，成功合成出具有独特三环桥环分子骨架的可见光吸收型光热剂。为发掘 520 nm 吸收型光热剂在深层组织治疗中的潜力，我们将其与上转换纳米颗粒（UCNPs）复合，得到复合材料 UPTA—— 其中上转换纳米颗粒作为近红外二区 - 可见光转换器，实现对光热剂的激发。我们将 UPTA 与热敏感一氧化氮（NO）前药共封装于水凝胶中，构建出气体 / 光热纳米复合材料。一氧化氮联合光热治疗具有强效的协同抗肿瘤功效。
实验结果与讨论
TQ 的分子合成与光物理性质
以 TP 和 TCNQ 分别作为富电子二烯和亲电子亲二烯体，通过无催化剂合成反应形成供体 - 受体（D-A）结构分子。出乎意料的是，通过一锅法级联反应得到了具有三环桥环 D-A 结构的分子，命名为 TQ。TQ 结构中并五苯部分的 6 位和 13 位碳为桥头碳，桥的 4' 位和 8' 位与一个五元环稠合，形成三环 [2,2,2,3,4',8']-7'-(氮烯) 茚骨架。基于晶体的电子密度，绘制了 TQ 的静电势图，红色部分（氰基）代表低电子密度。随后，对其吸收光谱和光致发光光谱（PL）进行了测试。主要吸收峰范围为 450-550 nm，最大吸收峰位于 470 nm，而最大荧光发射峰位于 640 nm。TQ 在乙腈 / 水混合体系中表现出显著的聚集诱导发光（AIE）特性，在水体积分数为 99% 时，荧光强度增强 50 倍。在水体积分数为 90% 时，荧光强度急剧增加，这可能归因于聚集形成过程中分子内运动受到限制。固态下的量子产率为 0.2%，表明非辐射失活是主要过程。为研究激发态能量耗散形式，利用红外热像仪监测了固态 TQ 的光热性能。结合 TQ 的吸收特性，选择 520 nm 激光（0.3 W/cm²）作为照射光源。结果显示，TQ 的温度在 20 s 内迅速升至 58℃，仅 30 s 内就达到 64℃；而不含 TQ 材料的对照组温度仅升高 2.5℃。经过 6 次加热 - 冷却循环后，TQ 仍能保持相同程度的升温，表现出良好的光稳定性。此外，其光热转换效率（PCE）经计算为 34%。同时，TQ 的二甲基亚砜溶液在 520 nm 激光（0.9 W/cm²）照射下，温度与浓度呈正相关，浓度为 1 mg/mL 时，仅 200 s 内温度就达到 100℃。高效的光热转换性能和良好的稳定性使其在光热成像中具有潜在应用价值。利用 TQ 粉末制作的 “5” 和 “叶片” 等卡通图案，在 520 nm 激光照射下温度显著升高，红外热像仪可清晰捕捉到明亮的成像效果。
UPTA 与 UPTA/SNP@H 的制备
为克服可见光激发型光热剂的局限性，我们将上转换纳米颗粒与 TQ 复合，开发出一种名为 UPTA 的复合材料。该材料不仅解决了组织穿透深度有限的问题，还展现出上转换纳米颗粒在增强光热治疗（PTT）效果方面的实际应用潜力。其中最关键的挑战在于 TQ 激发与上转换纳米颗粒发射之间的能量匹配。首先，我们选择并合成了核壳结构上转换纳米颗粒（NaYF₄:Yb³⁺/Er³⁺@NaYF₄:Yb³⁺/Nd³⁺）。由于壳层中存在 Nd³⁺和 Yb³⁺离子，该上转换纳米颗粒可被不同的近红外二区激光激发。经过核壳层间的一系列能量转移后，其会发射出约 525 nm、545 nm 和 650 nm 波长的光。上转换光热聚集体 UPTA 是通过疏水作用将 TQ 组装在所选上转换纳米颗粒表面制备而成。透射电子显微镜观察显示，TQ 以球形纳米颗粒的形式分布在六边形上转换纳米颗粒周围。值得注意的是，UPTA 可利用上转换纳米颗粒在近红外二区照射下产生的上转换发射光，通过福斯特共振能量转移（FRET）过程激发 TQ，从而实现光热应用。元素选区分析结果显示，材料中的元素分布完整，其中 C、N、Si 来自 TQ，Er、Na、Nd、F、Y、Yb 来自上转换纳米颗粒。实验证实，UPTA 的近红外二区光热效应极具优势，远优于其单一组分（上转换纳米颗粒和 TQ）。在 1064 nm 激光照射下，UPTA 的温度比室温升高了 30℃。当上转换纳米颗粒与 TQ 的摩尔比为 1:1、浓度为 200 μg/mL 时，UPTA 在 1064 nm 激光照射 5 分钟内温度升至 42℃，光热转换效率（PCE）经测定为 28%。通过交替加热 - 冷却循环测试不同复合比例 UPTA 的光热稳定性，结果显示所有比例的 UPTA 均表现出优异的光稳定性。其中，摩尔比为 1:1 的 UPTA 充分利用了上转换纳米颗粒与 TQ 之间的能量匹配，展现出卓越的近红外二区光热效应，成为深层组织治疗的潜在候选材料。
我们将一氧化氮前药硝普钠（SNP）与 UPTA 共负载于温敏水凝胶中，形成 UPTA/SNP@H。水凝胶基质作为生物相容性载体，不仅能响应局部热量实现药物的可控释放，还能延长治疗剂在肿瘤部位的滞留时间。扫描电子显微镜图像显示，该水凝胶具有均匀的三维孔隙结构，适合负载分子药物并促进其释放。元素 mapping 和能量色散谱分析证实，上转换纳米颗粒中的镧系元素与硝普钠中的 Na 在 UPTA/SNP@H 中分布均匀，表明 UPTA 和硝普钠已成功负载。为验证 UPTA/SNP@H 的光热性能，我们利用红外热像仪监测其在 1064 nm 激光照射下的升温情况。结果显示，5 分钟内其温度迅速升高至 51.5℃。将 UPTA/SNP@H 置于培养皿中并经 1064 nm 激光照射，5 分钟内水凝胶逐渐软化成溶液，表明其在近红外二区激发下具有温敏响应特性。流变学测试显示，在激光照射下，随着温度升高，UPTA/SNP@H 的储能模量和黏度均下降。此外，该水凝胶还表现出典型的剪切变稀行为，黏度随剪切速率增加而降低，这一特性确保了其可注射性，适用于生物医学应用。UPTA/SNP@H 在 400-600 nm 波长范围内具有宽吸收带，与组分 TQ 的吸收特性一致，且不受硝普钠和水凝胶的干扰。进一步研究发现，UPTA/SNP@H 中硝普钠释放的一氧化氮量与激光密度呈正比关系，实现了对一氧化氮气体释放浓度的有效调控（释放效率 37%），这对于诱导大量癌细胞凋亡至关重要。
UPTA/SNP@H 的体外癌细胞杀伤作用
得益于 UPTA/SNP@H 优异的近红外二区光热转换性能和一氧化氮（NO）气体可控释放能力，我们对其在乳腺癌治疗中的潜力进行了体外研究。首先，我们优化了负载不同浓度 UPTA 和 SNP 的 UPTA/SNP@H，以评估其对 4T1 细胞活力的影响。在无激光照射的情况下，UPTA/SNP@H 对正常 MCF10A 细胞和 4T1 癌细胞均无明显细胞毒性。而经 1064 nm 激光照射后，UPTA/SNP@H 表现出细胞毒性，当 UPTA 浓度为 160 μg/mL 时，可杀伤大部分癌细胞。
随后，我们设置了五个实验组来评估其对 4T1 乳腺癌细胞的治疗效果：无激光照射的 PBS 组（G1）、有激光照射的 PBS 组（G2）、无激光照射的 UPTA/SNP@H 组（G3）、有 1064 nm 激光照射的 UPTA 组（G4）以及有激光照射的 UPTA/SNP@H 组（G5）。G4 组的细胞活力降至 80%，表明 UPTA 具有光热治疗（PTT）效果；而 G5 组的细胞活力降至 31%，说明 UPTA/SNP@H 中的联合治疗相比单一光热治疗具有显著更高的细胞毒性。此外，G5 组中谷胱甘肽（GSH）水平的显著下降也表明，UPTA/SNP@H 可降低细胞活力并抑制 4T1 细胞的自我保护过程。我们采用荧光素二乙酸酯（FDA）和碘化丙啶（PI）双染色法区分活癌细胞（绿色荧光）和死癌细胞（红色荧光），以直观展示细胞毒性。共聚焦激光扫描显微镜图像显示，G1、G2 和 G3 组主要呈现绿色，表明细胞活力较高；而 G5 组的 4T1 细胞死亡数量显著多于 G4 组，说明一氧化氮联合光热治疗的疗效优于单一光热治疗。流式细胞术结果显示，经 1064 nm 激光照射的 UPTA/SNP@H 处理后，24.5% 的 4T1 细胞发生凋亡，而其他对照组几乎未观察到凋亡或坏死现象。我们进一步分析了癌细胞中可能的凋亡机制。通过 DAF-FM DA 检测发现，仅 G5 组出现强绿色荧光，表明在光热作用下 NO 得到有效释放。随后使用 JC-1 荧光探针评估线粒体膜电位，红色代表 JC-1 聚集体，绿色代表 JC-1 单体，G5 组的 JC-1 单体通道绿色信号显著增强，表明线粒体膜电位大幅丧失。此外，γ-H₂AX 检测显示，G5 组造成的 DNA 损伤最为严重。
原位乳腺癌的体内多模态成像
为评估近红外二区激发光热效应的优势，我们将 UPTA/SNP@H 涂覆在不同厚度（0.5 mm、1.0 mm 和 1.5 mm）的鸡胸肉组织上，模拟深层组织成像场景。值得注意的是，即使 UPTA/SNP@H 被 1.5 mm 厚的鸡胸肉组织覆盖，红外热像仪仍能观测到温度升高，这表明在 1064 nm 激光激发下，该材料具有深厚的穿透深度和有效的光热效应。这一优异结果促使我们进一步检测 UPTA/SNP@H 在 4T1 乳腺癌荷瘤小鼠体内的光热性能。红外热像仪观测显示，经 1064 nm 激光照射 6 分钟后，UPTA/SNP@H 处理组的肿瘤区域温度迅速升至 48.6℃。凭借其强大的光热性能，我们采用光声（PA）成像技术追踪 UPTA/SNP@H 在肿瘤区域的分布情况。结果显示，瘤内注射后 12 小时内，光声信号逐渐增强，随后在 24 小时和 48 小时因代谢清除而减弱，表明 UPTA/SNP@H 在注射后约 12 小时在肿瘤内达到最大蓄积量。
原位乳腺癌的体内协同治疗
为进一步评估光热联合一氧化氮疗法在体内对乳腺癌的治疗效果，我们建立了 4T1 原位乳腺癌 BALB/c 小鼠模型，以评估其杀瘤活性。详细的实验流程如下：当肿瘤体积达到 100 mm³ 时，将小鼠随机分为五组，分别为：无激光照射的 PBS 组（G1）、有激光照射的 PBS 组（G2）、无激光照射的 UPTA/SNP@H 组（G3）、有 1064 nm 激光照射的 UPTA 组（G4）以及有激光照射的 UPTA/SNP@H 组（G5）。每组小鼠接受相应处理后，每 2 天监测一次体重和肿瘤体积，治疗结束后处死小鼠并进行相关检测。治疗结果显示，G2 组和 G3 组的肿瘤体积与对照组 G1 类似，均每 4 天显著增大，表明这些处理无肿瘤生长抑制作用。相比之下，G4 组的肿瘤生长速率略慢于上述三组，提示单纯光热治疗的抗肿瘤效果相对较弱。而 G5 组的肿瘤生长完全停滞并趋于消退，体积从初始的 100 mm³ 降至 64 mm³。此外，提取肿瘤组织进行成像和称重发现，G5 组的肿瘤体积和质量均显著减小。同时，所有组小鼠在治疗期间的体重无明显差异，表明该治疗方案的副作用可忽略不计。为深入了解治疗机制，我们对不同处理后的肿瘤组织进行了组织学和免疫组织化学分析。苏木精 - 伊红（H&E）染色显示，G4 组和 G5 组的肿瘤组织出现大量细胞坏死，而其他组的坏死程度较轻。Ki-67 标记检测肿瘤细胞增殖能力发现，G5 组几乎无 Ki-67 阳性增殖细胞，表明肿瘤增殖显著受抑，凋亡增强。以 DAF-FM DA 为一氧化氮指示剂检测发现，仅 G5 组出现明显的一氧化氮生成荧光信号，其他组无明显荧光。同时，γ-H₂AX 检测显示，G5 组的肿瘤 DNA 损伤最为显著。
结论
本研究通过构建上转换增强型近红外二区吸收的高性能光热材料，并将其与热敏感一氧化氮前药（SNP）进一步整合到水凝胶中，开发出一种协同作用的近红外二区气体/光热治疗系统（UPTA/SNP@H），用于原位乳腺癌治疗。该纳米复合材料在 1064 nm 激光激发下，一氧化氮释放效率达 37%，且能穿透 1.5 mm 厚的鸡胸肉组织，实现深层组织渗透。此外，在 1064 nm 激光照射下，UPTA/SNP@H 在体外和体内均能有效抑制 4T1 肿瘤生长，一氧化氮与光热治疗的协同作用可诱导细胞凋亡，提升乳腺癌模型的治疗效果。体内治疗结果显示，该系统能持续抑制肺转移，促进肿瘤血管正常化，且具有优异的生物安全性和生物相容性。同时，本研究通过一种独特的一锅法 / 无催化剂的环加成-逆电环化-氰基-狄尔斯-阿尔德（CR-RE-cDA）反应，高效合成出具有独特三环桥环骨架的可见光吸收型光热剂。该合成方法流程简单、可操作性强，具有大规模生产潜力。通过将这种光热剂与上转换纳米颗粒（UCNPs）整合，我们建立了一种构建近红外二区光热剂的独特策略，使可见光吸收型光热材料能够应用于深层组织治疗，为肿瘤治疗开辟了更广阔的可能性。
参考文献
Upconversion boosts visible-light-absorbing photothermal agent for 1064-nm-driven photothermal/NO therapy ，Xinmeng Chen, Meng Lyu, Jialin Liu, Chunbin Li, Mingwang Yang,Jin Wang, Siwei Zhang, Jianwei Sun,Ryan T.K. Kwok, * Jacky W.Y. Lam, Lihua Li, Tianfu Zhang, * Lianrui Hu, * and Ben Zhong Tang，Cell Biomaterials 2, 100247, May 19, 2026，https://doi.org/10.1016/j.celbio.2025.1002
