内容提要
罗丹明染料是开发各种荧光探针的优良支架。罗丹明的一个关键性质是它们在无色内酯和荧光两性离子之间的平衡。调节内酯-两性离子平衡常数(KL-Z)可以优化染料的性能，用于特定的生物应用。我们使用已知的和新颖的有机化学来制备罗丹明染料的综合收集，以阐明控制KL-Z的结构-活性关系。提供电子的辅助色素与含氟的悬垂苯环串联工作，产生明亮的红移荧光团，用于活细胞单粒子跟踪(SPT)和多色成像。N-芳基auxochrome与氟化结合产生红移Förster共振能量转移(FRET)猝灭染料，用于创建一种新的半合成指示剂，用于使用荧光寿命成像显微镜(FLIM)检测cAMP。这项工作扩展了罗丹明合成的合成方法，为先进的荧光成像实验产生了新的试剂，并描述了将指导未来探针设计的结构-活性关系。
实验结果与讨论
含氟荧光团的合成
我们考虑了不同的方法来构建罗丹明染料，重点是合成较少探索的氟化衍生物。在之前的工作中，我们使用首先在实验室开发的合成方法制造氟化罗丹明，其中二(溴芳烃)进行金属/Br交换并添加到四氟苯酸酐(4)中以产生氟化罗丹明染料。这是对氟化罗丹明合成标准方法的补充，涉及质子或路易斯酸催化3 -氨基酚和4的缩合)。除了这些用氟化苯基体系构建染料的既定方法外，我们还考虑重新利用其他策略来合成氟化罗丹明。这些包括使用荧光素的pd催化交叉偶联和邻苯二醛酸与3-氨基酚或二苯基醚的氧化缩合。这两种方法都没有用于制造氟化罗丹明，但我们推测，分别使用氟化荧光素或四氟苯醛酸(5)可以合成所需的化合物。我们还考虑了一种新的策略，通过2,3,4,5-四氟苯甲酸(6)的锂化和添加到取代的山酮衍生物及其同族物来制备含氟染料。我们开始探索每种合成方法的范围，评估这些策略在制备标准含氧罗丹明、硅罗丹明和碳罗丹明以及基于荧光素和孔雀石绿的相关染料方面的效用。
乳酰缩合和氧化法合成氟化罗丹明
我们首先考虑了氨基酚与部分还原的邻苯二甲酸(邻苯二甲酸)在O2存在下的反应。这种最近描述的策略是一种高效和通用的区域选择性合成罗丹明染料的方法，包括羧基衍生物，但尚未应用于氟化染料。我们使用速记术语“乳酰缩合”来指代这种方法，因为邻苯二甲酸在溶液中大多采用封闭的3-羟基邻苯二甲酸(乳酰)形式。我们将此策略与先前描述的罗丹明合成方法进行了比较。金属/溴交换二溴7并添加到四氟眼苯酐(4)中，可得到收率为34%的新型氘化染料8;我们将这种荧光团命名为“JFX576”，因为它的氘取代45和它在水溶液中的最大吸收。二苯基醚9与四氟醇5在2,2,2-三氟乙醇(TFE)中反应，可以方便地以更高的收率(85%)获得8，证明了这种乳化学在制造氟化罗丹明方面的效用。然后，我们将这种乳酸缩合策略与经典的酸催化反应方法进行了比较，后者仍然是罗丹明合成的最常用方案，但在制备氟化罗丹明时显示出不同的结果。二氢喹啉10与4在回流丙酸中反应得到罗丹明11，收率低(8%);其他缩合反应条件都不成功。其中染料是使用标准酸介导化学以低收率制备的。二苯醚12与5反应生成11，产率为66%。
我们探索了其他氟化罗丹明染料的乳脂合成的普遍性。除了二苯基醚，如12,3 -氨基酚衍生物也被这种化学容纳。7 -羟基四氢喹啉(13)与5反应生成4,5,6,7四氟- q -罗丹明(FRhQ, 14)。8-羟基julolidine(15)与5反应得到罗丹明101的氟化衍生物(FRh101, 16)。二苯醚17(方案S1b)产生18，一种ATTO 550的氟化模拟物，我们称之为" Janelia Fluor 563 " (JF563)。最后，5与醚19反应得到化合物11的去甲基类似物20。我们注意到，使用仲胺反应物13、17和19的反应产率(27−57%)低于使用完全取代苯胺9、12和15(66−85%)，可能是由于涉及5的仲胺和醛互变异构体的副反应。
乳酰缩合法合成氟化硅罗丹明
罗丹明中的杂蒽氧取代硅部分会引起约100 nm的实质性深蓝移，使si -罗丹明成为有用的荧光团，可被长波光激发。与标准含氧罗丹明染料相比，这种取代也降低了KL−Z。如上所述，一些Si-罗丹明如JF646 (1)在水溶液中优先采用非荧光内酯形式，可用于创建显色/荧光标记。在悬置苯环上安装氟原子使内酯-两性离子平衡向两性离子形式转变，得到JF669 (2)，与非氟化同系物相比，一种染料显示出更高的ε值和更好的生物利用度1。考虑到JF669的效用，我们研究了氟化乳酰5的缩合来合成氟化Si-罗丹明染料，再次将这种化学反应与双(芳基金属)加成策略进行比较。这种乳酰缩合方法尚未用于制造任何氟化或其他形式的西罗丹明。如前所述，金属/溴交换二溴21并加入酸酐4得到Si-四甲基罗丹明的氟化衍生物(SiRF667;22)产率中等(52%)。使用2,2,2-三氟乙醇(TFE)在80°C和0.05 M的浓度下进行乳酰缩合，含硅变体的产率很低。我们以二芳基硅烷23为模型反应物，探索了不同的反应条件。用高沸点溶剂2,2,3,3,4,4,4-七氟-1丁醇(HFB)代替TFE，可在高温(95℃)下进行反应。这种溶剂变化，加上在更高浓度(0.2 - 0.3 M)下进行缩合，使Si-罗丹明22的产率(58%)与涉及双(芳基金属)物种的操作更复杂的反应相似。
利用Li/H交换的氟化碳胺和其他染料
我们探索了一类新型荧光团的合成:罗丹明和荧光素的含碳类似物，带有一个氟化的悬垂苯环。与标准氧桥罗丹明染料相比，宝石-二甲基碳取代基在吸收和发射波长上引起了~ 60 nm的色移，并向较低的KL−Z值偏移。与其他罗丹明一样，碳丹明的氟化应引起λabs和λem的进一步色移，并增加KL−Z，从而导致更高的吸收率。我们最初尝试使用二溴起始材料或乳缩合化学来获得氟化碳丹明。氘化二溴39的Li/Br交换和四氟眼酸酐4的添加得到碳丹明40 (JFX637)，产率中等(39%)。与氧和二溴化硅(例如7和24)的合成相比，39的合成时间更长，产率较低，而且相对复杂，这条路线变得复杂)。使用乳醇缩合条件将41与5反应不成功，即使延长反应时间(>72 h)，也只产生少量(<2%)染料40。这些问题与现有的合成方法促使考虑一种新的方法来制备碳己胺染料。在之前的工作中，我们通过芳基Grignards与二羟基蒽酮反应合成了碳荧光素;这些可以通过Pd催化的交叉偶联转化为碳胺。为了容纳t-丁基保护的羧基，使用格氏是必要的，但是这种芳基镁没有足够的活性来添加更多的富电子二氨基蒽并直接生成罗丹明染料。芳基锂试剂由于其增加的亲核性而限制了官能团的相容性，因此更常用于二氨基蒽醌的加成。除了最近的一个例子外，所有现有的羧基取代的碳罗丹明和硅罗丹明的合成都涉及锂/溴化物在严格保护的邻苯二甲酸等价物上的交换，并将得到的芳基锂物种加到二氨基蒽酮上。我们推测，使用MAC化学方法在后期加入6-羧基将最大限度地减少保护基团问题，并简化活性更强的芳基锂试剂的使用;定制的氟化苯基环还可以促进形成所需有机金属物质所需的交换、金属转化或去质子化。尽管如此，以前试图通过金属/卤化物交换产生含有受保护的2-羧基的四氟芳基锂试剂已被证明是不成功的。我们发现，无保护的2,3,4,5四氟苯甲酸(6)与2等量的正丁基锂直接金属化(即去质子化或Li/H交换)生成了二阴离子芳基锂，该锂易于与蒽酮42加成，与其他两种合成方法相比，氘化罗丹明JFX637(40)的产率更高(57%)。我们将这种新的Li/H交换方法应用于制备其他含氟染料。采用蒽酮43得到新型氮杂二基染料44 (JF632))收益率合理(53%)。同样，米氏酮(48)与6离子反应得到孔雀石绿内酯(FMGL;49)产率极佳(80%)。二(硅氧基)蒽酮50中加入锂化6，经TBAF脱保护得到氟化碳荧光素51。利用蒽酮52在该序列中得到高氟化的53，类似于弗吉尼亚橙54。该方法可以扩展到Si-蒽酮54，以提供已知的，高收率的，对pH敏感的氟化Si荧光素55。
路易斯酸催化缩合合成碳己胺
我们进一步扩大了氟化碳胺的收集。虽然二溴化和选择性锂化路线可以得到具有紧凑取代基的碳胺染料，如吡啶和氮杂啶，但这种化学反应对含有高度取代的融合环氧化色素的染料，如由还原喹啉或julolidine衍生的染料无效。34,55受专利文献中的一份简短报告的启发，56我们探索了一种不同的方法，回归到经典的酸催化化学，但使用Lewis酸AlCl3。双julolidine 56与四氟眼酸酐(4)在AlCl3存在下的反应，产率为68%的含氟碳罗丹明101类似物(JF660, 57)。同样，alcl3介导的58和4的缩合得到59,ATTO 647N的氟化类似物，收率很高(80%)。我们还利用这种化学方法高产地合成了罗丹明57和59的去氟类似物。相比之下，所有试图通过在含有julolidine基序的蒽醌中加入锂化或通过二溴化56或58合成57或59的尝试都不能提供可观数量的所需碳胺产物。
pd催化交叉偶联制备非取代罗丹明和N-芳基罗丹明
我们证明了荧光素与胺的交叉偶联是合成罗丹明染料的有效方法然而，由于全氟芳烃的亲电性，使用已知的4,5,6,7-四氟荧光素(60)或类似物，如51、53和55需要特别考虑。在我们的研究中，由于在必要的反应条件下(Cs2CO3, 80 - 100°C)，这些亲核物质在四氟芳基部分上容易发生取代反应，使用伯或仲脂肪胺伙伴的交叉偶联反应是不成功的。较少亲核的芳香胺或n -酰基衍生物与这些条件相容，允许合成新的染料。60、含碳类似物51和硅荧光素55与三酸酐反应得到三酸盐61−63。与n -甲基苯胺交叉偶联得到n -芳基罗丹明64−66。同样，二酰基罗丹明67−69也可以通过二三酸荧光素与氨基甲酸丁酯的交叉偶联得到。用TFA去保护t-Boc基团得到罗丹明110衍生物70 (FRh110)， 71 (FCRh110)和72 (FSiRh110)。我们注意到，氟化罗丹明110变体在很大程度上是未知的，专利文献中只有一个简短的报告，详细介绍了通过酸催化合成以低收率(~ 5%)合成4,5,6,7-四氟orh110(70)。这些结果表明，氟化二三酸荧光素可以用于交叉偶联反应，尽管其范围仅限于较少的亲核氮反应物。
荧光团的光谱特性
上述工作代表了含有O、C或Si桥接取代基、氟化或非氟化悬垂苯环和不同的氧化色素基团的荧光素和罗丹明的综合集合。我们通过检测荧光素变体，测量每种染料的λabs、λem、消光系数(ε)和荧光量子产率(Φf)，开始研究它们的光谱特性(表1)。荧光素及其衍生物具有对pH敏感的光谱特性，因此我们还确定了pKa值，并通过确定从pH滴定数据计算的希尔系数(ηH)来研究pH介导的光谱变化的协同性。与先前描述4,5,6,7-四氟荧光素(60)和4,5,6,7-四氟-硅荧光素(55)的工作一致，染料51和53中的四氟苯基环体系在λabs和λem中引起了>15 nm的色移，并且相对于母体碳荧光素(74)和弗吉尼亚橙(78)染料具有较低的pKa。荧光团51和53表现出非合作的pH驱动跃迁，ηH≈1。这与碳荧光素74和78的行为相反，它们不含全氟环体系，并且随着pH值的降低显示出从有色到无色的合作转变(ηH > 1)。即使安装了氟化环系统，si荧光素55和80也保持协同pH滴定。这些数据揭示了邻羧基的亲核性和染料的内酯化倾向之间的微妙相互作用，这种相互作用控制了质子化后合作的类醌→内酯转变。这种理解将有助于指导基于红移荧光素类似物的pH传感器的未来发展。
我们研究了罗丹明(表2)，测量了标准光谱特性(λabs， ε， λem和Φf)以及KL-Z。16与之前的数据一致，我们观察到悬浮苯环的氟化使λabss和λem增加了15 ~ 25 nm;与它们的去氟类似物相比，氟化染料也表现出小约5纳米的斯托克斯位移。这种修改也适度地增加ε和降低Φf。Lewis酸催化缩合法合成碳胺的研究用Pd催化交叉偶联法从荧光素合成从杂蒽体系到缺电子垂环的光诱导电子转移(PET)的能隙定律绘制Φf vs λabs图显示，氟化和非氟化染料的趋势没有实质性差异，从而支持能隙定律假设。Carborhodamine 86 (JF608)的λabs/λem = 608 nm/631 nm， ε = 99,000 M−1 cm−1，Φf = 0.67。氟化类似物JF632(44)表现出红移光谱(λabs/λem = 632 nm/649 nm)，较高的吸光度(ε = 139,000 M-1 cm-1)和较低的Φf = 0.54。这些趋势反映在类似的氘化JFX染料88和40中。同样，先前报道的si - q -罗丹明(95)的λabs/λem = 637 nm/654 nm， ε = 77,000 M-1 cm-1，Φf = 0.38。氟化类似物29呈现出色移，λabs/ λem = 659 nm/675 nm，较高ε = 124,000 M-1 cm-1，较低ε = 0.25。在非荧光n -芳基罗丹明中也存在λabs和ε的这些趋势。罗丹明90的λabs= 549 nm，吸光度适中(ε = 16000 M-1 cm-1);氟原子的加入增加了最大吸收和消光系数(λabs= 570 nm;ε = 81700 M-1 cm-1)。
我们检查了不同染料系列的内酯-两性离子平衡;KL-Z在1:1 (v/v)的二氧六环:水混合物中测量。这些条件为识别结构-活性关系提供了广泛的必要值范围。绘制与KL-Z的auxochrome结构图显示了两个总体趋势。首先，氟化普遍增加KL-Z;根据染料结构的不同，这种变化范围从2个数量级(例如，1→2)到2倍(例如，97→57)。其次，KL-Z强烈依赖于桥接取代基(Si(CH3)2;C (CH3) 2;O)。桥接取代基对KL-Z的影响已经确定，但对氧化色素基团(特别是高给电子基团)的依赖尚未得到严格的探索。虽然大多数这些官能团的Hammett常数是未知的，但根据取代偶氮苯染料的数据，生成素基团的给电子能力可以排序为NH2 <氮啶<吡啶<四氢喹啉< julolidine。其中si -罗丹明SiRh110(83)和JF646(1)的KL−Z≈10−3,JFX650(89)和SiRhQ(95)的KL-Z≈10−2，含julolidine的SiRh101(98)的KL-Z≈1。在相应较高的KL-Z值下，碳胺和罗丹明染料的生成素的给电子特性与KL-Z之间也存在相关性。N-芳基生成素显著降低了内酯-两性离子平衡。罗丹明90的KL-Z= 0.296相对较小，但氟化使平衡常数升高;64例KL-Z= 4.36。总的来说，这些数据表明罗丹明通常倾向于内酯形式，如SiRh110 (83;ε = 2,200 M-1 cm-1,KL-Z= 0.0011)，可以通过协同结构修饰(引入给电子的辅助色素和氟取代基)来调整，得到JF698(31)，一种在水溶液中具有高吸收率的染料(ε = 147,000 M-1 cm-1,KL-Z= 4.57)。我们还注意到含有给电子取代基的染料，如julolidine，表现出更高和更压缩的KL-Z范围。这使得这种支架对于构建明亮，高吸收的标签具有吸引力- ε与KL-Z相关，但可能限制微调此类荧光团以获得诸如提高生物利用度或显色性等特性的努力。最后，我们比较了含氧和含硅罗丹明与更复杂的氧化色素取代基。同样，氟改性普遍引起λabs和λem变长，Stokes位移变小，ε和KL-Z变大，Φf变低。例如，四氢喹啉罗丹明99 (ATTO 550的自由染料形式)的λabs/λem = 542 nm/564 nm， ε = 112,000 M-1 cm-1，Φf = 0.83, KL-Z= 6.30。氟化类似物18 (JF563)表现出红移光谱(λabs/λem = 563 nm/581 nm)，较高的KL-Z = 15.3和吸光度(ε = 125,000 M-1 cm-1)，略低的Φf = 0.73。含硅罗丹明100和34的四氢喹啉也遵循这一趋势。二氢喹啉染料(11、20、36、38和101−104)的KL-Z=值低于四氢喹啉染料(18、34、99和100)和结构更简单的克罗丹明染料(14、29、93和95)，说明这种扩展的共轭体系使KL-Z=向内酯形式转变。这些数据还表明，与四氢喹啉si -染料100和34 (Φf≈0.3)以及直接类似的含氧罗丹明101、20、103和11 (Φf = 0.64−0.83)相比，含二氢喹啉si -罗丹明体系(102、36、104和38)的Φf≤0.03具有显著降低。这表明含二氢喹啉的染料支架的扩展偶联促进了Si-罗丹明体系中的非辐射衰变途径，使此类染料作为荧光标记的吸引力降低。
用MAC化学合成卤素标签配体
有了这个扩大的氟化染料集合，我们测试了MAC化学衍生化策略，制备了8 (JFX576)、11、18 (JF563)、25 (JFX673)、29 (FSiRhQ)、31 (JF698)、36、38、40 (JFX637)、44 (JF632)、49 (FMGL)、51、55、57 (JF660)、59 (JF657)、60、64−66和70−72的HaloTag配体。无论染料反应物结构如何， MAC化学反应都以优异的收率进行。我们注意到，这种方法甚至对荧光素51和55也是成功的，荧光素具有亲核酚取代基，可以与亲电环系统或酰基氰化物中间体反应。我们评估了非氟/氟染料配体对的HaloTag标记率:84HTL/85HTL、81HTL/70HTL、86HTL/44HTL、87HTL/8HTL和88HTL/40HTL，其中氟化合物的标记率适度降低了4- 14倍。染料配体- HaloTag偶联物被证明是稳定的，无论氟化，罗丹明110类似物在细胞中有效地标记了HaloTag融合蛋白，新型氟化碳达明44 (JF632)和40 (JFX637)显示了与先前报道的si -罗丹明染料JF646 (1HTL)和JFX650 (89HTL)在单颗粒跟踪(SPT)实验中的性能相当。总之，这些数据表明，氟化不会对活细胞实验中的染料性能产生不利影响。
ATTO 647N的活细胞荧光成像研究
我们选择了三种新的氟化染料化合物来更仔细地研究生物成像应用。我们首先关注的是新型碳硼胺59(它是ATTO 647N (105)。“著名的”67 ATTO 647N可能是体外单分子成像的最佳染料，并已被广泛用作先进成像实验的标签。然而，由于结构限制，ATTO 647N共轭物尚未用于活细胞成像实验。在许多ATTO染料中使用的一个关键设计原则是用4-(甲胺)丁酸对垂环上的正羧基进行酰胺化。这种偶联策略做了三件事:(i)引起光谱性质的色移，使λabs > 640 nm，比未修饰的母体染料(λabs = 632 nm);(ii)通过阻断内酯化强化可见吸收形式;(iii)提供了用于生物偶联的羧酸片段，从而避免了同分异构体混合物的问题。然而，这种策略有一个不幸的副作用，因为它去除了邻羧酸盐的负电荷，导致衍生化后的阳离子物种。ATTO 647N-HaloTag配体(105HTL)应用于表达组蛋白H2B -HaloTag融合蛋白的活细胞时，在细胞核中没有明显的标记，而是染色线粒体。这与阳离子罗丹明衍生物在活细胞线粒体中积累的倾向是一致的。我们的氟化荧光团的方法反映了使用邻羧基进行生物偶联的光谱和结构优势，但不会产生阳离子物种。氟取代使λabs/λem发生变色，并与julolidine和tetrahydroquinoline auxochromes协同作用，通过将内酯-两性离子平衡转变为两性离子形式来提高吸收率和亮度。通过直接的MAC化学方法引入反应处理保留了染料的两性离子特性，这应该最大限度地减少不必要的线粒体积累。59的两个非对映体显示出相同的光谱性质:λabs = 657 nm， ε = 137,000 M-1 cm-1，λem = 672 nm， Φf = 0.50, KL−Z = 4.97。根据这些数据，我们将其命名为“JF657”，并在不分离非对映体的情况下制备了JF657−HaloTag配体(59HTL)(方案S8)。用59HTL孵育表达组蛋白H2B−HaloTag融合蛋白的细胞，洗涤后细胞核染色良好，细胞背景较少。然后，我们将59HTL在SPT实验中的性能与目前同类最佳的远红染料配体JFX650-HaloTag配体(89HTL)。我们观察到以光子/秒测量的亮度显著提高。随着时间的推移，新型JF657也表现出一致的定位，而JFX650表现出相对快速的漂白。因此，氟化和MAC化学允许古老的ATTO 647N支架用于活细胞，由此产生的染料JF657代表了SPT标签的新标准。
近红外(NIR)光激发荧光成像研究
近红外区域是生物成像的一个有吸引力的窗口，具有低自身荧光，较少散射和相对较深的组织穿透。我们考虑了表现为λabs≈700−750 nm的染料，并对si -罗丹明101 (JF698;31日);其ε = 147,000 M-1 cm-1和Φf = 0.28使其亮度与Alexa Fluor 700和Cy7相似，但具有活细胞标记应用的潜力。我们将JF698−HaloTag配体(31HTL)与其他nil激发的标签进行了比较，包括si -罗丹明36HTL和38HTL，以及我们之前报道的基于JF722 (106HTL)和JF711 (107HTL) 16我们还制备了另外两个nir激发的荧光团。我们的Li/H交换法得到sir70031,71(108)的氟化衍生物;MAC化学提供了它的HaloTag衍生物108html。108的光谱性质为λabs = 712 nm， ε = 98,800 M-1 cm-1，λem = 735 nm， Φf = 0.09, KL−Z = 1.97;我们给它命名为SiRF712。我们改进的乳酰缩合条件使37和乳酰109反应生成110，这是104的6-羧基衍生物。与HaloTag配体胺111酰胺化得到104HTL。我们在活细胞中测试了这些NIR激发的HaloTag配体的效用。所有标记的表达HaloTag的活细胞以相似的动力学融合到组蛋白H2B，但强度不同。与31在体外的优越亮度一致，HaloTag配体衍生物31HTL在λabs激发时的核强度比其他配体高3倍以上。细胞强度第二高的HaloTag配体是SiRF712化合物(108HTL)。二氢喹啉si -罗丹明(36HTL、38HTL和104HTL)在细胞中表现出较低的强度;这是基于它们极小的Φf值。JF698−HaloTag配体(31HTL)也比含氧化膦的JF711 (107HTL)和JF722 (106HTL)更亮，光稳定性更好)，使用650 nm激发的JFX650-SNAP-tag配体(89STL)和其他可见吸收荧光标记进行简单的多色成像实验。
总结
罗丹明仍然是活细胞成像中最重要的荧光团，并且越来越多地用于更复杂的系统，例如完整的动物。优化这些特定应用的荧光团需要合成化学方法来制造新的罗丹明，并了解控制染料光谱和化学性质的结构-活性关系。在这里，我们深入研究了罗丹明染料的合成，研究了五种不同的方法。我们开发了新的和改进的化学，扩大了氧化邻苯二甲酸(“乳”)缩合42合成氟化和非氟化Si-罗丹明(方案4和方案5)的范围，并建立了利用2,3,4,5-四氟苯甲酸直接Li/H交换合成氟化染料的新途径(6;计划6−8)。我们使用这些方法组装了一套系统的罗丹明染料，并测量了它们的性质。这些数据揭示了控制内酯-两性离子平衡(KL-Z)，这是罗丹明在生物系统中性能的关键决定因素我们发现含julolidin的染料强烈地向两性离子形式转移，而N-芳基染料倾向于内酯形式。我们还发现，无论化学结构如何，悬挂苯基环的氟化都可以增加KL-Z，我们利用这一效应制备了用于细胞成像的新试剂，借助于我们之前描述的MAC试剂衍生化策略我们制造了阴离子JF657(59)，一种与阳离子ATTO 647N相兼容的活细胞模拟物，在SPT实验中具有取代目前同类最佳染料JFX650的性能。我们利用氟诱导的深变色和KL−Z位移来制造JF698(31)，一种明亮的NIR激发染料，可实现多色成像。这项工作也指导了新型荧光探针的开发。在合成这种全面的染料集合和详尽的测量它们的化学性质之前，控制不同类别罗丹明的吸收率和KL-Z的结构-活性关系似乎是特殊的。例如，人们几十年前就认识到含有高Φf量的julolidine染料，但据我们所知，julolidine对ε的影响在很大程度上没有被认识到。我们表明，吸收率和KL-Z的趋势可以通过氧化色素基团的给电子能力来解释。染料设计者应该选择一种能够获得所需光谱和化学性质的罗丹明支架。含有NH2或氮杂啶的罗丹明可以获得广泛的KL-Z值，可用于制作各种探针，包括显色或生物可利用试剂。含有julolidine的罗丹明具有较窄的KL-Z范围，可能更适合于创建具有增强吸收率的明亮标签。小分子荧光探针合成化学的进步与新的标记策略相结合，正在推动荧光显微镜试剂领域的复兴。许多小分子荧光团——包括罗丹明——在19世纪被发现;相关的古老化学严重限制了新衍生物的合成。在新化学领域的投资会产生新的染料，从而使新的实验成为可能，并最终产生新的生物学发现。我们不再需要问“我们能制造什么荧光团?”，而是“我们应该制造什么样的荧光团?”我们希望，这项全面的有机化学研究和对结构-活性关系的新见解，结合对染料光物理的更好理解，优化的计算化学方法和机器学习，将为研究复杂的生物系统带来新的工具。
参考文献
Optimized Red-Absorbing Dyes for Imaging and Sensing，Jonathan B. Grimm, Ariana N. Tkachuk, Ronak Patel, S. Thomas Hennigan, Alina Gutu, Peng Dong, Valentina Gandin, Anastasia M. Osowski, Katie L. Holland, Zhe J. Liu, Timothy A. Brown, and Luke D. Lavis*， J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 23000−23013，https://doi.org/10.1021/jacs.3c05273
