内容提要
短波红外(SWIR, 1,000-1,700 nm)和扩展SWIR (ESWIR, 1,700-2,700 nm)区域的体内荧光成像在诊断成像中具有巨大的潜力。虽然图像对比度已被证明随着波长的增加而提高，但在这些区域发射的有机荧光团的设计和合成是具有挑战性的。在这里，我们合成了一系列硅基罗丹明 (SiRos)荧光团，其峰值发射波长为1,300-1,700 nm。我们表征荧光团光物理(稳态和时间分辨)，电化学和计算使用时间依赖的密度泛函理论。使用两种荧光团(SiRos1300和SiRos1550)，我们配制纳米乳剂，并将其用于小鼠心血管系统的全身循环SWIR荧光成像。这些研究产生了高分辨率的SWIR图像，在整个循环系统中可以看到清晰的脉管系统。该SiRos支架建立了产生长波发射SWIR和ESWIR荧光团的设计原则。
结果与讨论
荧光团的设计与合成
硅基罗丹明(SiRos)染料的合成利用了2-溴-4-氯-1-碘苯的三种不同卤化物中的每一种来迭代构建SiRos核心供体官能团。醇1是由2-溴-4-氯-1-碘苯和2-溴-4-氯苯醛合成的;随后用BF3/SiEt3H脱氧生成二芳基甲烷2，产率为99%。与二氯(2-乙基己基)硅烷反应时，双溴化锂与2交换形成环化硅烷中间体。该粗中间体用KMnO4氧化得到酮产物3，总收率为37%。选择2-乙基己基取代基是为了(1)在核心处加入可溶解基团，以帮助简化合成;(2)增加荧光团的立体性，以减少聚集;(3)在核心处加入庞大的基团，以减缓亲核攻击，这在以前的吲哚-杂蒽荧光团的迭代中观察到。用氯芳基3和钯催化剂对吲哚嘧啶给体基团4-6进行C-H活化，以46-88%的产率生成硅取代的xanthones 7-9。最终染料通过一锅反应顺序合成，首先用2,6-二甲苯基溴化镁进行格氏反应生成醇中间体，然后用2 M HClO4 (aq)进行酸性加成形成荧光团。通过格氏反应安装二甲苯基团是染料设计的一个组成部分，因为关于杂蒽核心的较大的邻基已经证明了对水解分解的稳定性增加。虽然SiRos1300可以直接从酸性沉淀中分离出来，但SiRos1550和SiRos1700需要在二氯甲烷(CH2Cl2)中与无水Na2CO3进行额外的双相反应才能使DMA基团去质子化。这一过程通过吸收光谱进行监测，因为质子化胺衍生物表现出与SiRos1300几乎相同的吸收，并且随着去质子化反应的进行，吸收光谱出现了红移。
稳态吸收和发射光谱
吸收光谱显示，SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700在CH2Cl2中分别在1,140 nm、1,348 nm和1,440 nm处具有显著的低能量最大值。氧与硅在杂蒽核中的交换导致从先前报道的rosindz到SiRos1300的吸光度最大值(0.25 eV (210 nm))发生了红移。这与过去文献报道的与烷基胺供体的传统罗丹明染料观察到的0.34 eV (90 nm)的色移相当(图1)35。SiRos1550在CH2Cl2染料系列中具有最大的摩尔吸收率(ε)，为122,000 M-1 cm-1，而SiRos1300和SiRos1700分别为115,000 M-1 cm-1和98,000 M-1 cm-1(表1)。正如之前对1,7-DMA吲哚嘧啶供体34观察到的那样，吲哚嘧啶1位额外的DMA与2位苯环之间的空间相互作用使SiRos1700的摩尔吸收率降低到98,000 M-1 cm-1。与SiRos1300和SiRos1550相比，吸收谱更宽。虽然所有的染料在浓缩时几乎是黑色的，但SiRos1300是无色的，SiRos1550是橙色的，而SiRos1700在吸收和发射光谱(~1 × 10-5 M)浓度下是绿色的，因为它的可见区吸收带能量更高。染料在乙腈(CH3CN)中的吸收也进行了研究，以了解溶剂极性增加如何影响染料的光物理性质。对于所有染料，观察到吸收谱线在CH3CN中变宽并向高能量方向移动，ε降低到CH2Cl2中所观察到的一半以上。总的来说，较低的摩尔吸收率、向高能量的转移以及吸收特征的展宽表明，随着溶剂极性的增加，染料可能开始从π→π*体系向n→π*电荷转移体系转变。我们还研究了染料在D2O溶液中的DSPE-mPEG2000胶束中的吸收情况(由于D2O相对于H2O的吸收波长更长)，以观察染料在模拟水胶束环境中的吸收情况(补充图3)。与CH3CN中染料的吸收光谱相似，观察到染料在胶束中的吸收光谱与CH2Cl2相比变宽和强度降低。在胶胞-D2O环境中，吸收变宽可能是由于聚集体的形成或溶剂极性的增加。目前，有机小分子的最低能量λemis最大值为1,380 nm，SiRos1550和SiRos1700分别超过了~170 nm和~320 nm。CH2Cl2中材料的发射光谱与吸收光谱基本一致，说明吸收光谱中的肩部特征本质上是振动的。CH2Cl2的发射光谱也显示出几个地方的发射强度急剧下降，其中最明显的是在1700 nm处。这些发射强度的急剧下降与CH2Cl2的吸收光谱一致，并且归因于溶剂的再吸收，正如之前在SWR发射材料中看到的那样。在此，溶剂重吸收校正按照方法中概述的方法进行，以使发射光谱更加清晰。使用方法中的公式(4)和(5)发现SiRos1300在CH2Cl2中的ΦF为0.0056±0.0007%(相对于IR-1061 ΦF在CH2Cl2中的0.32±0.04%)。IR-1061的ΦF被选为标准，因为它在文献中有全面的表征，其中使用了几种方法来显示该染料可获得的ΦF参考值的广泛变化。SWIR中最常见的参考染料之一(IR-26)在文献中具有ΦF参考值，其范围为一个数量级;因此，比较论文之间的ΦF值需要小心。然后将该系列中的所有其他染料与CH2Cl2中的SiRos1300进行比较(表1)。测量到SiRos1550的ΦF为0.0025±0.0003%(约为SiRos1300的一半)，而SiRos1700的ΦF为0.0011±0.0003%(约为SiRos1550的一半)。这里发现的ΦF值是针对原始发射光谱的，经过溶剂重吸收校正后会略有增加，因为SiRos1550和SiRos1700由于溶剂重吸收而丢失了相当大一部分的综合发射强度。我们还在D2O中收集了DSPE-mPEG2000胶束内部的发射光谱，以了解染料在水微细胞环境中的分子亮度。选择D2O作为溶剂是因为它比H2O吸收波长长~300 nm的光(参考文献)。36岁,40)。SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700胶束内部的ΦF值分别为0.0068±0.0009%、0.0021±0.0003%和0.0007±0.0001%。应该强调的是，据我们所知，没有有机小分子材料在该光谱区域(>1,400 nm)发射，并且SWIR中的信噪比严重依赖波长，使得低能量发射比牺牲信号强度更有价值。
我们在D2O中分别观测到SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700的λemis max分别为1,241 nm、1,475 nm和1,500 nm(表1)。SiRos1550和SiRos1700的发射光谱再次超过了之前最低能量观测到的λemis max (CH2Cl2)分别为~95 nm和~120 nm。SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700在D2O中的发射光谱不反映吸收光谱，这可能是由于胶束中存在染料的非发射聚集态，这些染料负责光吸收而不是荧光发射。由于D2O在1900 nm处的强吸收特性，SiRos1550和SiRos1700的发射光谱似乎在~ 1900 nm处的D2O处急剧切断(补充图11-13)。SiRos1300和SiRos1700在D2O和CH2Cl2中分别在1800 nm和2200 nm处的λemis起始值与在CH2Cl2中观察到的值相似;然而，由于D2O溶剂的吸收，无法观察到SiRos1550的λemis起始，本文估计其λemis起始>1,900 nm。虽然SiRos1700的λ发射起始点同样受到D2O吸收的影响，但其可观测到的发射强度超过了D2O吸收特征，表明其真实发射起始点为2200nm。总的来说，这三种染料在有机溶剂和水胶束中都表现出明显的SWIR发射，并显示出作为SWIR有机小分子成像材料的前景。分子亮度(MB = ε × ΦF)定义为材料的摩尔吸收率与荧光量子产率的乘积;这是比较荧光团的相对亮度的有用度量，因为它既说明了荧光团吸收了多少光，又说明了它随后发射该光的效率。SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700在CH2Cl2中的分子亮度值分别为6.4 M-1 cm-1、3.1 M-1 cm-1和1.1 M-1 cm-1(表1)。当考虑到SiRos材料的大色移时，这些值与其他发出siro的杂蒽荧光基团(如VIX-4)所观察到的值相似。
密度泛函理论计算
采用Gaussian 16软件，以CH2Cl2为隐式溶剂，在B3LYP/6-311g(d,p)理论水平上对SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700进行随时间密度泛函理论计算。计算预测的垂直跃迁能趋势与CH2Cl2的实验λabs max趋势一致，即SiRos1300 < SiRos1550 < SiRos1700。前沿分子轨道分析表明，HOMO主要分布在吲哚嘧啶给体和辅助性DMA给体上，在发色团核心上分布较少。HOMO在辅助DMA给体上的离域表明这些给体对π-体系的贡献很大，因此对垂直跃迁能有很大的影响。LUMO轨道分布表明，轨道系数主要分布在发色团的核心上，并在一定程度上分布在吲哚嘧啶给体上，DMA基团没有明显的贡献。HOMO和LUMO之间的这种轨道分布的移动表明了这些材料的一些电荷转移特征，并且可以解释与π→π*体系(如花菁)相比，摩尔吸收率较低，这表明了异常的HOMO/LUMO重叠。在非极性非质子溶剂(CH2Cl2)和极性非质子溶剂(CH3CN)之间切换时，所观察到的电荷类转移特征也与实验观察到的一致，与CH2Cl2相比，CH3CN的吸收变宽，摩尔吸收率降低。SiRos1550和SiRos1700也具有更高的能量跃迁(振荡强度> 0.10)。SiRos1550为675 nm, SiRos1700为917 nm和648 nm。这些跃迁在CH2Cl2中染料的吸收光谱中很明显，因为SiRos1700的最低能量特征被展宽，这与计算预测的917 nm跃迁一致。SiRos1700在700 nm附近也具有广泛的特征，这与计算预测的648 nm跃迁一致。同样，SiRos1550在800 nm左右有一个跃迁，这与计算预测的675 nm的跃迁一致。
体内成像实验
研究了菜籽油基纳米乳液，以允许长时间的体内成像。用Pluronic F-68表面活性剂在磷酸盐缓冲盐水中乳化菜籽油制成纳米乳液。随后，通过摇动混合物至少1小时，将溶解在丙酮中的SiRos1300或SiRos1550装入纳米乳液。请注意，SiRos1700被排除在成像实验之外，因为本文使用的SWIR相机的范围不能捕获大部分发射。通过离心过滤器(分子量截止值= 10,000 Da, 4,000 r.p.m)连续三次旋转洗涤swr -发射纳米乳液。或3739 × g)，然后在体内使用前通过吸收光谱、SWIR相机发射和动态光散射进行表征。SiRos1300纳米乳液的平均尺寸为260 nm，多分散性指数为0.44;SiRos1550纳米乳液的平均尺寸为194 nm，多分散性指数为0.27。负载SiRos1300和siros1550的纳米乳剂的吸收光谱显示出与染料在有机溶剂中的吸收非常相似的特征，表明纳米乳剂中的荧光团的单分子行为(顶部)。在相同成像条件下，观察到SiRos1300纳米乳液的亮度大约是SiRos1550纳米乳液的两倍(底部)。
SiRos1300和SiRos1550纳米乳剂都表现出优异的空间分辨率，这是SWIR荧光成像的一个特征。在尾静脉注射后不久，两种纳米乳剂均分布于整个循环系统，小鼠腹部、颈静脉和股动脉等区域的血管清晰可见。SiRos1300和SiRos1550的截面强度，观察到SiRos1300沿颈静脉产生比SiRos1550更大的峰值信号强度(~120 a.u)。相对于~100 a.u.)和股动脉(~120 a.u.)。相对于~70 au)横截面，而两种荧光团沿腹部横截面(~80 au)产生相当的峰值信号强度。此外，注射两种纳米乳剂的小鼠在注射两周后显示出可检测的信号。
由于其低能量发射，SiRos1300, SiRos1550和SiRos1700准备利用SWIR区域的优势，包括:(1)在1,400-1,600 nm的高对比度区域成像;(2)更大深度成像;(3)扩展多路复用能力。我们已经通过SiRos1300和SiRos1550的毛细管成像实验证明了这些途径的潜力。SiRos1300和SiRos1550在1400 nm和1500 nm长通滤波器成像时都显示出鲁棒信号。为了评估使用低能量波长对深度穿透的影响，我们将SiRos1300和SiRos1550的亮度，以及其他三种具有更高能量λemis max的荧光团:JuloChrom5 (872 nm)， Chrom7 (996 nm)， JuloFlav7 (1,088 nm)进行了均衡。我们在不同深度的1%脂肪内对这5根毛细血管进行了成像，脂肪内是一种常用的组织假体。具有较长波长的染料的毛细血管可以在更深的深度分解。使用1,400 nm的长通滤波器，只有SiRos1550可以在4 mm深度分解，而SiRos1300, JuloFlav7, Chrom7和JuloChrom5分别在3.5 mm, 3 mm, 2.5 mm和2 mm深度分解。使用1,500 nm长通滤波器可以看到类似的结果，只有SiRos1300和SiRos1550在4毫米深度可分辨。这与先前的脂质内实验一致，表明使用较长波长的发射器具有优越的深度穿透和分辨率。最后，SWIR区域的一个重要优势是扩大了适用于组织成像的光谱窗口，便于多色实验。SiRos染料扩展到以前未被生物相容性荧光团到达的区域。SiRos1300能够与JuloChrom5和Chrom7一起复用。由于激发激光器的限制，我们无法增加用于多路复用的通道数量，但随着技术的进步，这应该能够实现。SiRos染料证明了技术和探针开发之间相互作用的重要性，这些染料超越了当前SWIR成像装置的最佳激发和发射范围。
总结
本文设计并合成了一系列SiRos荧光团，并对其光物理性质进行了表征。SiRos1300、SiRos1550和SiRos1700的λemis max分别为1,300 nm、1,557 nm和1,700 nm，荧光量子产率分别为0.0056%、0.0025%和0.0011%(均为CH2Cl2)。在皮秒范围内观察到该系列的光致发光寿命，以及寿命和发射能量的相反趋势，其中SiRos1700 > SiRos1550 > SiRos1300。观察到的光致发光寿命趋势归因于单线态和三重态激发态的潜在混合，因为荧光团的光学间隙减小。荧光团的时间依赖密度泛函理论分析与SiRos1700 > SiRos1550 > SiRos1300的吸收波长和垂直跃迁的染料系列中观察到的趋势相匹配。从非极性非质子溶剂(CH2Cl2)转换为极性非质子溶剂(CH3CN)时，分子前沿轨道显示了部分电荷转移行为，实验观察到吸收宽度变宽，摩尔吸收率降低。在菜籽油纳米乳液中使用SiRos1300和SiRos1550进行体内SWIR成像实验。该制剂在小鼠股动脉、腹腔和颈静脉血管中具有全循环分布和高分辨率成像。总的来说，这项工作说明了未来长波发射SWIR荧光团的设计原则。未来的工作重点是在ESWIR区域设计水溶性荧光团和高量子产率荧光团。此外，在中波红外(3,000-5,000 nm)区域发射的荧光团正在根据这些设计原则进行研究。
参考文献
Silicon-RosIndolizine fluorophores with shortwave infrared absorption and emission profiles enable in vivo fluorescence imaging,William E. Meador , Eric Y. Lin , Irene Lim , Hannah C. Friedman , David Ndaleh , Abdul K. Shaik , Nathan I. Hammer , Boqian Yang , Justin R. Caram , Ellen M. Sletten* & Jared H. Delcamp*，Nat. Chem.， https://doi.org/10.1038/s41557-024-01464-6
