内容提要
“一应俱全”光疗法是指单一组件同时具有多种光学成像和治疗方式，因其在癌症治疗中的优异表现而受到广泛关注。由于具有平衡多种相互竞争的能量耗散途径的优势，聚集诱导发射发光物质(AIEgens)被证明是构建“一应俱全”的多模态光疗剂的理想模板。由近红外二区(NIR-II, 1000-1700 nm)光触发的全方位AIEgens尚未报道。鉴于NIR-II激发光的组织穿透深度和最大允许曝光量高，本文充分利用AIEgens的单分子通用性优势，同时最大化分子的供受体强度和构象畸变，首次报道了具有多模态光疗特性的NIR-II激光可激发AIE小分子(命名为BETT-2)。系统的体外和体内评价充分证明了BETT-2纳米颗粒(NPs)在NIR-II光驱动荧光-光声-光热三模成像引导光动力-光热协同治疗原位小鼠乳腺肿瘤中的高性能。这项工作为开发NIR-II激光激活的一刀切光疗系统提供了有价值的见解。
实验结果与讨论
分子的设计与光物理性质研究
通常，强D-A强度和扭曲共轭骨架的巧妙结合已被证明是开发具有长吸收和发射波长的AIEgens的有效策略。在本研究中，含有丰富的甲氧基修饰的TPE-TPA作为强电子给体，大空间位阻的EDOT作为π-bridge和第二电子给体，高吸电子的苯并[1,2- ' c:4,5c ']和[1,2,5]噻二唑(BBTD)或硒取代的BBTD (SBTD)作为强受体框架，分别共价连接构建了化合物BETT-1和BETT-2。其中，TPE-TPA的螺旋桨状构象和EDOT的大空间位阻共同扭曲了整个分子骨架，既保证了期望的AIE特征，又为分子内的活性运动提供了足够的空间，为非辐射热失活提供了可能。由此产生的强D-A效应有望减小电子带隙并增强ISC过程。此外，为了获得更长的吸收和发射波长以及更好的光疗性能，在分子设计中进行了Se原子取代S原子的受体。我们首先用紫外-可见-近红外光谱和光致发光(PL)光谱仪研究了这两种化合物的吸收和发射行为。如图1D所示，BETT-1和BETT2在CHCl3溶剂中具有较长的吸收和发射波长，这是由于它们的结构中存在强烈的电子D-A相互作用。值得注意的是，BETT-2的最大吸收峰和发射峰分别达到915 nm和1240 nm，与BETT-1的818 nm和1104 nm相比，虽然只有一个原子的差异，但却发生了明显的色移。更重要的是，BETT-2有相当一部分吸收光谱落在NIR-II窗口内，为NIR-II激光激发光疗提供了前提条件。此外，BETT-2几乎所有的发射光谱都位于NIRII区域，这对NIR-II FLI来说绝对是有利的。进一步的密度功能理论计算表明，BETT-2的最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)之间的能隙(Eg)最小，为1.12 eV。此外，BETT-2的Eg值低于BETT1 (1.26 eV)，可能是由于重原子含硒受体的亲电性比s取代受体强。随后，采用DMSO/乙醇作为混合溶剂，加入不同的乙醇组分(fE)，研究了它们的AIE性能。结果发现，两种化合物在纯DMSO溶剂中均表现出弱荧光，随着乙醇比例的增加，其荧光逐渐增强，明确表明其具有良好的AIE活性。值得注意的是，当fE达到90%时，可以观察到BETT-2的明亮的NIR-II荧光，这表明BETT-2在NIR-II FLI中聚集的潜力。此外，当fE进一步提高到95%时，荧光强度出现突然下降，这可能是由于在过高的贫溶剂比下，较大的BETT-2团聚体沉降所致。
纳米粒子光热性质研究
这些AIEgens在常见的有机溶剂中具有良好的溶解度，易于通过纳米沉淀法包被两亲性聚合物形成NPs。结合FDA批准的DSPE-mPEG2000，顺利制备了水溶性BETT-1和BETT-2 NPs。通过动态光散射(dynamic light scattering, DLS)表征，这两种NPs均具有良好的单分散性，水合粒径分别约为80.24 nm和79.12 nm，这是在增强渗透性和滞留性(enhanced permeability and retention, EPR)效应驱动下在肿瘤部位积聚的合适尺寸。进一步的透射电子显微镜(TEM)成像显示，这些NPs具有均匀的球形形貌，其尺寸比DLS得到的相应尺寸小，这是由于干燥的TEM样品中NPs表面没有水化层。此外，它们的zeta电位分别为- 35.2和- 36.5 eV，具有相当负的表面电荷，这有利于它们的胶体稳定性和延长体内血液循环。与CHCl3溶液中的对应分子相比，两种NPs在水溶液中的吸收和发射峰几乎没有变化。值得注意的是，在1064 nm形成NPs的两亲性基质中，BETT2 (1813.56 m−1 cm−1)的摩尔吸光度(0.10)明显高于BETT-1 (426.23 m−1 cm−1)，为NIR-II (1064 nm)激光激发光疗提供了更多的能量输入。虽然BETT-2 NPs在1064 - 1500 nm波长范围内的荧光量子产率(QY)(0.13%)低于BETT-1 NPs(0.39%)，但BETT-2 NPs的高/ 1064 nm弥补了这一不足。BETT-2 NPs (2.36 m−1 cm−1)的1064 nm激光激发NIR-II荧光亮度(λ 1064 nm Φf > 1064 nm)仍优于BETT-1 NPs (1.66 m−1 cm−1)。这种增强是实现高信噪比荧光成像的关键。为了便于比较，表S1给出了两种化合物及其NPs的光物理性质总结。我们进一步研究了它们的ROS生成和光热转换能力。首先，采用2’, 7-二氯二氢荧光素二醋酸酯(DCFH-DA)指示剂来指示NIR-II光触发这些NPs的ROS生成。在1064 nm激光照射下，DCFH本身几乎不发射，而在BETT1 NPs或BETT-2 NPs存在下，DCFH在525 nm处的荧光信号随着1064 nm激光照射时间的延长而明显升高。在激光照射10分钟后，所有NPs诱导的DCFH发射强度都增加了100倍以上，清楚地表明它们具有可观的ROS生产能力。此外，我们还利用特定的指标来确定BETT-2 NPs产生的ROS类型，包括单线态氧(1O2)指示剂9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)、超氧自由基(O2−•)指示剂二氢膦胺(DHR123)和羟基自由基(•OH)指示剂羟基苯基荧光素(HPF)。研究结果表明，BETT-2 NPs能够通过I型途径产生O2−•。然后，研究了NIR-II光引发的两种NPs的光热转换行为。在1064 nm (1.2 W cm−2)激光照射下，BETT-1 NPs和BETT-2 NPs水溶液的温度在2分钟内迅速升高，这应该归因于它们的扭曲构型和结构丰富的转子以及由此产生的剧烈的分子内运动。光照5 min后，BETT-1 NPs和BETT-2 NPs (AIEgen, 100 μg mL−1)的最高温度分别达到47.12℃和62.23℃。值得注意的是，BETT-2 NPs的升温幅度高达33.81℃，明显高于BETT-1 NPs的升温幅度(18.37℃)。值得注意的是，BETT-2 NPs实现了高达56.6%的光热转换效率，高于BETT-1 NPs(48.2%)和大多数先前报道的NIR-II光热剂。由此可见，BETT-2 NPs在1064 nm激发下优于BETT-1 NPs的光热加热性能主要得益于它们在1064 nm处的较高的驱动因子。两种NPs样品的温升与材料浓度或激光功率密度呈正相关，表明通过方便地调节这些因素可以很容易地操纵产热。此外，在7个加热-冷却循环中，BETT-2 NPs样品的最高加热温度几乎保持不变，证明了它们具有出色的光热稳定性。综上所述，BETT-2 NPs具有较长的吸收和发射波长、较高的1064 nm波长、较亮的NIR-II荧光、令人满意的ROS生成能力和优越的光热性能，有望成为NIR-II激光可激发多模态光治疗剂，用于后续的癌症治疗。
纳米粒子的体外研究
针对BETT-2 NPs在可见光区无发射的情况，为了在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下观察，制备了异硫氰酸荧光素(FITC)标记的BETT-2 NPs(简称FITC-BETT-2 NPs)，该NPs可以发出绿色荧光，用于细胞内跟踪。如图3A所示，小鼠乳腺癌4T1细胞与FITC-BETT-2 NPs孵育3小时后，呈现出明亮的绿色荧光信号。同时，与LysoTracker Red和Hoechst 33 342商用荧光探针共染色，发现NPs主要通过溶酶体介导的内吞作用进入细胞。此外，利用低温条件(4°C)和四种特定的内吞抑制剂(NaN3、氯丙嗪、制霉菌素和阿米洛利)来检测BETT-2 NPs的细胞摄取途径。这项研究证实了一个主要由网格蛋白介导的能量依赖性内吞过程。然后进行CCK-8测定，以确定暗照射和激光照射条件下BETT-2 NPs对4T1细胞的细胞毒性。结果表明，在我们设定的浓度范围内，NPs对4T1细胞没有明显的暗毒性，具有良好的生物相容性。在1064 nm激光照射下，随着NPs浓度的增加，细胞活力明显降低，当BETT-2浓度增加到75 μg mL−1时，90%以上的细胞被消灭，表明BETT-2 NPs具有超强的光致癌细胞杀伤能力。随后，以DCFH-DA为指标，研究BETT-2 NPs细胞内ROS生成情况。为了便于比较，将细胞分为四组:PBS、PBS +激光(L)、BETT-2 NPs和BETT-2 NPs + L。CLSM图像显示，只有BETT-2 NPs +激光照射(1064 nm, 1.0 W cm−2,5 min)处理的细胞产生了明亮的绿色荧光，而在其他对照组中则检测不到这种信号，证明4T1细胞内的BETT-2 NPs在光启动后产生了显著的ROS，这是因为它们具有良好的光敏性。为了观察BETT-2 NPs的光疗效果，用双醋酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)对这四种不同治疗组的4T1细胞进行染色，以区分死细胞和活细胞。正如预期的那样，在三个对照组中观察到FDA的固体绿色荧光，而在BETT-2 NPs + l的实验组中，几乎所有的4T1细胞都出现了明显的PI红色荧光。这些结果肯定表明BETT-2 NPs具有出色的协同PDT-PTT杀细胞效率。验证了光驱动治疗的可控性和所采用激光功率的安全性。采用Annexin V-FITC/PI检测试剂盒进行细胞凋亡分析，采用荧光活化细胞分选(FACS)进一步探讨细胞死亡机制。结果表明，经BETT-2 NPs + 1064 nm激光照射后，约48.19%的癌细胞诱导凋亡，7.58%的细胞诱导坏死，而其他组细胞凋亡或坏死均不明显。
纳米粒子的体内成像研究
通过尾静脉注射BETT-2 NPs，研究1064 nm激光激发NIRII FLI-PAI-PTI三模成像引导PDT-PTT协同治疗原位4T1乳腺肿瘤小鼠的体内应用。在此之前，NIR-II光的优越性主要是通过覆盖不同厚度的鸡胸组织优于BETT-2 NPs溶液来评估的。首先，在特定浓度范围的1064 nm激光照射下，可以观察到BETT-2 NPs的NIR-II荧光信号具有明显的浓度依赖性。值得注意的是，即使NPs样品被6mm厚度的鸡组织覆盖，NIR-II荧光信号仍然可以检测到。这些突出的结果表明，1064 nm激光和NIR-II荧光的穿透深度很大，表明BETT-2 NPs在niir - ii激发光疗的体内具有相当大的潜力。因此，在配备1064 nm激光的商用NIR-II体内成像系统上，研究了BETT-2 NPs在荷瘤小鼠NIR-II FLI中的表现。在1250 nm的长通(LP)滤光片下，小鼠在NPs注射前(0 h)无荧光信号，说明背景干扰极小。在注射后3小时，由于EPR效应驱动的BETT-2 NPs在肿瘤部位的被动靶向积累，肿瘤组织可以被清楚地点亮。随着时间的推移，在观察期间的12 h，肿瘤上的NIR-II荧光亮度最高，富集量最大。此外，肿瘤组织和各器官的离体NIR-II FLI进一步表明，尽管在单核吞噬系统(MPS)的主要器官肝脏和脾脏也存在明亮的荧光信号，但BETT-2 NPs会在肿瘤部位有效积累。与NIR-II FLI结果一致，肿瘤部位的光声信号也表现出时间依赖性的增强趋势，直到注射后12 h达到最大强度。PAI对肿瘤的表面和内部组织进行了描绘。此后，由于代谢作用，24 h荧光和光声信号下降。考虑到肿瘤富集程度最大，选择注射后12 h作为后续光疗的时间点。由于BETT-2 NPs具有良好的光热转换特性，因此有望在1064 nm激光照射下对肿瘤产生显著的光热效应。红外摄像机实时记录温度显示，经静脉注射BETT-2 NPs 12 h后，1064 nm激光照射2 min，肿瘤部位温度从36.7℃迅速上升到57.0℃，当照射时间延长至10 min时，肿瘤温度达到61.3℃，无疑满足肿瘤热疗所需要的温度。相比之下，在相同条件下，给盐小鼠仅表现出可忽略不计的温度变化。综上所述，上述数据有力地证明了BETT-2 NPs在肿瘤的NIR-II FLI、PAI、PTI三模态成像中表现良好，极大地促进了后续肿瘤部位特异性协同光疗，有效避免了对正常组织的不良损伤。
纳米粒子体内治疗研究
评估NIR-II激光驱动的BETT-2 NPs对原位4T1乳腺癌的杀瘤活性。同时以不加激光照射的BETT-2 NPs和加/不加激光照射的生理盐水作为对照组。在全身给药生理盐水或BETT-2 NPs 12 h后进行NIR-II激光照射(1064 nm, 1.0 W cm−2,10 min)。肿瘤生长曲线显示，随着时间的推移，这些对照组的肿瘤体积迅速增加，在治疗15天后，肿瘤体积比原始值增加了约14倍。此外，除1064 nm激光照射或单独注射BETT-2 NPs对肿瘤消退的影响外，各组间肿瘤体积无显著差异。与此形成鲜明对比的是，NIR-II激光照射BETT-2 NPs组的肿瘤早在第3天就被完全根除。令我们非常兴奋的是，在研究期间没有发现肿瘤复发，治疗15天后仅在治疗部位留下疤痕，这有力地证明了NIR-II激光激发PDT-PTT具有出色的协同杀瘤效果。通过组织和免疫组织化学分析进一步阐明了BETT2 NPs的超NIR-II激光抗肿瘤性能。BETT-2 NPs + L组肿瘤切片的H&E染色结果显示肿瘤细胞明显空泡化、核固缩。同时，免疫荧光染色包括TUNEL、CD31和Ki67检测显示，1064 nm激光照射的BETT-2 NPs可诱导明显的细胞死亡，抑制新血管增殖，抑制肿瘤细胞增殖。
总结
本文首次构建了一个可被1064 nm激光激发的多模态AIE活性光治疗小分子。通过将多个分子转子、强大的电子给体和受体同时集成到高度扭曲的给体-π-acceptor-π-donor (D-π-A-π-D)分子骨架中，BETT-2成功地被赋予了长波吸收和密集聚集诱导的NIR-II发射。制备的BETT-2 NPs在1064 nm激光照射下具有良好的ROS生成和较高的光热转换能力。体内实验证实，具有优良生物安全性和适当大小的BETT2 NPs可优先在肿瘤部位积累，从而实现特异的NIR-II荧光-光声-光热三模态肿瘤成像。因此，在给予BETT-2 NPs后，实现了1064 nm激光激活的原位乳腺癌PDT-PTT，提供了完全消除原位4T1肿瘤。本研究为NIR-II型光激发型一刀切光疗剂的设计提供了创新的指导，为癌症治疗的实际应用提供了参考。
参考文献
An NIR-II Excitable AIE Small Molecule with Multimodal Phototheranostic Features for Orthotopic Breast Cancer Treatment ，Shanliang Song, Yue Zhao, Miaomiao Kang, Fei Zhang, Qian Wu, Niu Niu, Hao Yang, Haifei Wen, Shuang Fu, Xue Li, Zhijun Zhang,* Ben Zhong Tang,* and Dong Wang*，Adv. Mater. 2024, 36, 2309748 ， https://doi.org/10.1002/adma.202309748
