内容提要
第二近红外区(NIR-II, 900 ~ 1880 nm)荧光成像的小分子染料在临床应用中具有很大的前景。构建供体-受体-供体(D - A - D)结构已被认为是实现NIR-II荧光的可行策略。然而，通过这种方案开发NIR-II染料受到缺乏高性能电子受体和给体的阻碍。吡咯双酮(DPP)是一种经典的有机光电材料，具有强光吸收、高荧光量子产率、易衍生化等特点。然而，它在NIR-II成像领域的应用一直受到其有限的吸电子能力和DPP的平面结构导致的聚集引起的猝灭(ACQ)效应的阻碍。本文以DPP为电子受体，通过给体工程，我们成功地设计并合成了DPP基染料T-27，该染料具有很强的D -A相互作用，具有优异的近红外吸收和高亮度的NIR- ii荧光尾发射。T-27通过在给体单元上有策略地引入长烷基链来增加分子间距，减少溶剂分子的影响，在水溶液中表现出更好的抗ACQ效果。经DSPE-PEG2000包封后，T-27纳米颗粒(NPs)在水中的相对NIR-II荧光QY为3.4%，是目前报道的DPP基NIR-II染料中最高的。T-27 NPs出色的光物理特性使其能够在808 nm激发下进行多模NIR-IIa生物成像。因此，T-27 NPs可以区分小鼠股静脉和动脉，并实现穿透深度为800 μm的脑血管显微成像，具有高分辨率的深部组织成像能力。这项工作在生物成像领域具有重要的潜力，并为开发明亮的NIR-II染料提供了新的策略。
实验结果与讨论
分子设计与合成
为了构建具有明亮NIR-II荧光的DPP基染料，选择双噻吩基二酮吡咯(bisthiophenyldiketopyrorolopyrrole, SDPP)作为电子受体。它具有平面骨架、易于改变的化学结构和较强的分子内电荷转移(ICT)效应，可使吸收波长红移至NIR-I区，有效提高分子吸收能力。在SDPP芯的两端引入长烷基链，以提高其在有机溶剂中的溶解度，同时保护SDPP芯免受水分子的猝灭作用。其次，我们没有选择经典的TPE或TPA作为电子给体，而是引入了更强的电子给体单元，通过Buchwald-Hartwig偶联反应将环戊二噻吩(CPDT)连接到4,4 ' -二甲氧基二苯胺上，从而增强了D - A效应。更强的D−A效应有利于高效的ICT，从而降低带隙，实现进一步的红移吸收和发射波长在一定程度上，4,4 ' -二甲氧基二苯胺的扭曲构象有助于减少分子间的相互作用，也可以看作是一个小的分子转子，可能会赋予分子间距，减少聚集状态下π−π堆积相互作用。通过Stille耦合反应，成功地将电子给体和电子接受体连接到T-27上。
溶液态的光物理性质
在二氯甲烷(DCM)溶液中，T-25和T-27分别在690 nm和715 nm处表现出最大吸收。由于CPDT组件比吲哚噻吩具有更强的给电子能力，T-27在更长的波长区域具有更好的吸收性能。T-27的吸收扩展到900 nm左右。T-25和T-27在DCM中的最大发射波段分别位于800 nm和900 nm左右。由于T-27的供体能力更强，因此其发射红移更大，这与理论计算结果一致。T-27的Stokes位移可达~ 200 nm，这主要是由于激发态的几何弛豫，使得π共轭主链变得平坦。值得一提的是，大的斯托克斯位移对荧光团的要求很高，因为它可以防止自吸收效应，以增加荧光成像的SBR。此外，T-27的荧光发射延伸至1400 nm，表明其具有用于深部组织NIR-II成像的潜力。在极性环境下，D - A- D体系的分子内扭曲诱导了从局部激发态(LE)到分子内电荷转移态(TICT)的转变，由于HOMO能级的升高和能带间隙的缩小导致了红移发射。然而，TICT状态容易发生非辐射猝灭过程，导致发射强度显著降低。我们测量了T-27和T-25在不同极性溶剂中的吸收和发射光谱，以评估这些D−A结构分子的TICT效应。在低极性溶剂中，T-27和T-25都表现出非常明亮的荧光，具有明显的发射峰。随着溶剂极性的增加，T-25和T-27的吸收峰与发射峰相比变化不大，发光峰红移、变宽、明显减小。当溶剂由低极性DCM变为高极性DMSO时，相同浓度下T-25和T27的荧光强度分别下降了34倍和9倍。虽然两种分子的荧光强度都下降了，但T-27的下降幅度明显小于T-25。在供体单元上引入长烷基链可以有效地提高T-27的荧光性能。
TICT态和聚合态的光物理性质
我们使用THF/水系统研究了它们在聚集时的发射波动。随着水分数从0增加到40%，荧光强度逐渐降低，这主要是由于TICT态的形成。两种化合物的发射最大值也逐渐发生红移。然而，当水分数达到40%时，T-27在发射最大值中表现出轻微的蓝移。这可能是由于T-27上的多个长烷基链，使其在聚集状态下更容易形成低极性微环境。当水含量增加到50%和60%时，两种荧光团的荧光强度都有显著增强，同时在发射最大值中出现明显的蓝移。在含水量为60%时，T-27和T-25的荧光分别恢复到其初始荧光强度的50%和35%。一方面，由于聚集程度的增加，荧光增强，这限制了分子内的运动。另一方面，T-27表现出更大的荧光强度增加，这可能是由于在电子供体上引入了长烷基链。长烷基链可以对分子内运动施加空间位阻，有利于在聚集态下形成更疏水的环境，从而产生更强的荧光。从70%到90%的水分数，T-27和T-25的溶解度进一步降低，导致荧光团聚集更密集。由于两种化合物的高平面度，不可避免地会发生π−π堆积现象。π−π叠加和TICT的共同作用导致荧光强度进一步降低。然而，T-27对应的荧光下降速率和程度明显小于T-25，这可能是由于引入了提供位阻的长烷基链，增加了分子间间距，减少了π−π堆叠的影响。值得注意的是，当含水量达到90%时，T-27的荧光强度保持在初始值的25%。这一观察结果表明，T-27由于其结构优势，可以减轻ACQ效应的影响，这被认为是一种抗ACQ效应。此外，在90%水分数时，发射最大值开始红移，表明聚集体状态可能发生了变化。
NIR-II生物成像
由于T-27表现出优异的光物理性质，我们通过将其包被DSPE-PEG2000来提高其在生物系统中的水分散性和生物相容性。通过DLS和透射电子显微镜(TEM)测量，T-27纳米颗粒(NPs)表现出良好的水分散性，显示出直径约为112 nm的均匀球形结构。此外，在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，T-27 NPs在7天的时间内表现出出色的胶体稳定性，没有沉淀迹象。此外，储存7天后，NPs的大小和形态发生了微小变化。T-27 NPs表现出典型的NIR-I吸收和NIR-II荧光，在700 nm处的最大吸收处有轻微的蓝移。T-27 NPs在吸收最大值处的摩尔消光系数略有下降;然而，由于吸收变宽，808 nm处的摩尔消光系数略有增加，达到1.98 × 104 M−1 cm−1。在808 nm激光连续照射30 min的情况下，T-27 NPs的吸收和荧光强度没有明显下降，表明其具有良好的光稳定性。以IR-26为参照，测得NIR-II区T-25 NPs和T-27 NPs的相对荧光QYs分别为1.5和3.4%。据我们所知，在DPP基NIR-II染料中，T-27 NPs具有最高的QY。T-27 NPs优异的吸收和荧光效率是高质量生物成像特别需要的。
首先，我们在体外对T-27 NPs进行了初步的荧光性能评价。T-27 NPs的荧光强度随浓度线性增加，表明其具有定量成像的能力。即使在1300 nm的长通(LP)滤波器下，在808 nm激光的激发下，T-27 NPs也表现出强烈的荧光信号。实现更深的组织穿透对于揭示潜在的组织结构至关重要，但长期以来一直是荧光成像的一个具有挑战性的方面。
为了进一步验证T27 NPs的成像性能，我们使用1%脂质内溶液模拟生物组织的散射特性。我们将T-27 NPs的结果与商用近红外成像造影剂，即吲哚菁绿(ICG)获得的结果进行了比较。ICG溶液的选择浓度为0.1 mg/mL,51 T-27 NPs为0.5 mg/mL。在0 ~ 0.5 mg/mL浓度范围内，由于ACQ效应，ICG在0.1 mg/mL时荧光效果最佳。无论激发光源如何，T-27 NPs在所有深度下均比ICG在1%脂质下表现出更好的成像性能。值得注意的是，在0 ~ 2 mm深度范围内，690 nm激发下的T-27 NPs的SBR明显高于808 nm激发下的SBR。这是由于T-27在690 nm处的摩尔消光系数比在808 nm处高。然而，当深度进一步增加到3 ~ 5 mm范围时，808 nm激发比690 nm激发表现出更好的成像性能。在808 nm激光激发下，T-27 NPs在4mm深度处的SBR达到了2.2。即使在5 mm深度，毛细血管轮廓也清晰可见，而ICG在相同深度几乎无法检测到荧光信号。这突出了T-27 NPs在深部组织成像方面的特殊潜力。
全身血管成像
荧光血管成像对血液疾病和癌症的诊断具有重要意义。通过给小鼠静脉注射T-27 NPs或ICG，我们使用带有1300 mm LP滤光片的InGaAs相机记录了NIR-II全身血管图像。很明显，与ICG相比，T-27 NPs可以提供更高分辨率的血管网络图像。在两种激发波长下，T-27 NPs处理小鼠后肢血管区图像的SBR均显著高于ICG，其中808 nm激发下的成像质量最好。半最大值时最小全宽度(FWHM)为0.61 mm，最大SBR为5.5。为了观察血管的细节，我们放大了小鼠后肢的血管，增加了法兰焦距。令人印象深刻的是，后肢血管的放大图像可以清楚地区分先前难以识别的股动脉和股静脉(股动脉，FWHM1 = 0.53 mm, SBR = 3.1;股静脉，FWHM2 = 0.59 mm, SBR = 3.2)。我们还对躯干区域的血管进行了比较分析。在某种程度上，识别血管，特别是肝脏区域的血管，存在强烈的干扰，是困难的。T-27 NPs可以明显区分肝脏区域的血管，而ICG几乎无法完成这项任务。与上述结果一致，在808 nm激光激发下，T-27 NPs表现出最佳的成像性能。这些发现共同证明了T-27 NPs具有出色的成像性能。长激发波长降低了光子散射和组织自身荧光，提高了SBR，提高了提供早期疾病诊断信息的准确性。
NIR-II成像在淋巴系统和手术导航中的应用。
淋巴系统(包括淋巴管和淋巴结)的可视化和切除在癌症的检测和治疗中具有重要意义。受T-27 NPs在血管系统中出色的成像性能的鼓舞，我们尝试将其用于淋巴成像。将T-27 NPs注射到小鼠脚垫后，立即观察到腘窝和腰椎LNs发出明亮的荧光信号。随着LP滤光范围的变化，淋巴结和淋巴管的SBR图像呈现出相当大的变化。在1300 nm LP滤波器下，原本模糊的LNs轮廓变得清晰，分辨率小至1.26 mm (LN1)和1.88 mm (LN2)。这种改进可归因于减少了发射光子在NIIIA区域的散射和吸收，导致更高的信噪比。
为了探讨在NIR-II成像指导下LN切除的可行性，我们在正常小鼠上模拟手术过程。由于相当高的SBR, ln被精确切除，避免对周围肌腱和神经造成不必要的损伤。切除组织尺寸分别为1.16 mm (LN1)和1.56 mm (LN2)，与体内荧光图像的尺度非常吻合。此外，注射T-27 NPs后，我们在不同的时间间隔内跟踪荧光信号。我们发现淋巴区清晰的荧光信号可以观察到长达8小时。由于手术时间的不确定性，较长的停留时间有利于手术导航因此，可以预见T-27 NPs在实际临床外科手术中的潜力。
高空间分辨率脑血管NIR-II显微成像
NIR-II荧光成像在提供对生理和病理条件下深部脑组织复杂形态学特征的基本见解方面起着关键作用。16,17这项技术是推进基础脑科学研究和临床前诊断的有力工具。在静脉注射T-27 NPs后，通过颅窗可以精确地观察小鼠大脑血管网络。通过精心调整样品台和物镜的空间方向，可以有效捕获不同垂直深度的脑血管发出的NIR-IIa荧光信号。T-27 NPs在描绘深部脑组织方面表现出卓越的能力，能够在0 ~ 800 μm的垂直深度范围内记录来自脑血管的NIR-IIa荧光信号。小脑血管的宽度分别为3.85、2.98和3.81 μm，在200、400和600 μm的深度下可以清晰地分辨出来，显示出很高的SBR。值得注意的是，由于成像深度的增加，即使在800 μm处SBR有所降低，仍然可以观察到复杂的血管形态。T-27 NPs的激发波长延长，再加上它们的NIR-IIa荧光发射特性，导致自身荧光和光子散射的影响大大降低。因此，这种先进的NIR-IIa脑血管成像系统所表现出的卓越分辨率和更高的SBR强调了其在体内成像应用领域的显着优势。
总结
我们通过增强长烷基链的给电子能力和给电子体，成功地设计并合成了DPP核和D−π−A结构的荧光团(T-27)，在NIR-II区具有高荧光亮度。由于强的D−A相互作用和大的π共轭作用，T-27具有良好的吸收性能，与808 nm激发相适应。此外，我们还观察到，在THF/水混合物中，随着水组分的增加，T-27经历了从分散态到J -团聚态再到H -团聚态的转变。尽管如此，在电子给体上引入烷基链可以部分地限制分子内运动，增加分子间距离，阻碍π−π在聚集态的堆积，赋予抗acq效应，提高其荧光性能。在含水量为90%时，T-27的荧光强度仍保持在初始荧光强度的25%，明显高于传统ACQ分子。T-27优异的光物理特性激发了我们将其应用于NIR-II生物成像。将T-27 NPs包封到DSPE-PEG2000中，以IR-26为参比，其相对荧光定量为3.4%。在808 nm激光激发下，T-27 NPs具有血管成像、动态成像、手术导航和脑血管显微成像等多种NIR-IIa成像模式，具有高分辨率和深入组织穿透能力。它代表了DPP基材料在NIR-II成像中的最佳性能。这项工作为设计和合成高性能NIR-II小分子染料开辟了新的途径。
参考文献
Promoting the Near-Infrared-II Fluorescence of Diketopyrrolopyrrole-Based Dye for In Vivo Imaging via Donor Engineering， Tao Yuan, Qiming Xia, Zhiqiang Wang, Xinsheng Li, Hui Lin,* Ju Mei,* Jun Qian,* and Jianli Hua* , ACS Appl. Mater. Interfaces 2024, 16, 4478−4492, https://doi.org/10.1021/acsami.3c16784
