内容提要
合成染料与遗传编码蛋白标签的化学遗传学融合为体内成像提供了一条有前途的途径。由于缺乏在组织透明度近红外窗口(NIR, 700 - 1700 nm)中工作的明亮和荧光染料，其充分潜力受到阻碍。我们报道了2X-罗丹明(2XR)，这是一种新型结构，允许开发活细胞兼容，NIR激发的变体，具有超过1000 nm的强荧光性。2XR采用刚性π骨架，具有双原子桥，并通过基于螺体的荧光机制发挥作用。该设计提供了更长的波长，更高的量子产率，并且与目前使用的近红外荧光罗丹明相比，增强了水中的荧光性。我们展示了它们在视频速率动态成像和靶向深层组织分子成像中的出色表现。我们开发了2XR变体2XR715-HTL，这是一种近红外荧光配体，用于HaloTag蛋白，使近红外基因编码的钙传感成为可能，并首次展示了超过1000 nm的体内化学遗传标记。我们的工作扩展了近红外荧光工具库，为化学遗传学方法的体内成像和传感铺平了道路。
实验结果与讨论
2XR染料的计算与合成
我们对2XR支架的25个衍生物进行了理论计算，X1和X2从NCH3、O、S、C(CH3)2或Si(CH3)2中自由选择。我们的研究结果表明，虽然X1和X2对最高/最低已占据分子轨道(HOMO/ LUMO)能级都有不同程度的贡献，但X2的变化显著降低了LUMO能级，其顺序为NCH3 < O < S < C(CH3)2 < Si(CH3)2。这个趋势与X1无关。根据X1和X2的组合，HOMO - LUMO能隙(Eg)的范围为1.96 ~ 2.88 eV，表明其光谱覆盖范围很广。当X2为C(CH3)2或Si(CH3)2时，可以观察到Eg的显著降低。当(X1, X2) = (O, C(CH3)2)， (S, C(CH3)2)和(NCH3, Si(CH3)2)时，2XR衍生物的LUMO水平相似，分别为−3.77，−3.76和−3.73 eV。这些值与SiRh (- 3.74 eV)相当，高于PRh (- 4.07 eV)和SO2Rh (- 4.29 eV)。这表明它们不容易形成内酯形式，并且可能具有与SiRh相似的KL−Z值。然后，我们优先开发(S, C(CH3)2)-2XR结构，因为计算上，由于其平面和大π共轭，与PRh和SO2Rh相比，它表现出轻微的红移。
2XR染料的光学性质
利用2XR-1研究了(S, C(CH3)2)-2XR支架的光物理性质，因为它具有“永远打开”的荧光特性。在EtOH中，2XR-1在725 nm处有一个强的近红外吸收峰，在765 nm处有一个发射峰，绝对量产率高(ΦF = 0.27)。在磷酸盐缓冲液中，量子产率保持较高(ΦF = 0.11)，与某些改进的1XR变体(JF722: 0.11)相当，优于大多数红移变体(SO2R2: 0.073;JF724: 0.05)。在第二个近红外(NIR-II: 1000 ~ 1700 nm)区域观测到明亮的发射尾(占总发射的3.4%)。根据其比例计算，其量子产率为0.92%(表1)，与目前用于NIR-II成像的大多数染料的水平一致。此外，2XR-1具有较长的荧光寿命(在DCM中为5.3 ns，在EtOH中为2.9 ns，在磷酸盐缓冲液中为1.1 ns)，并且以Cy7为参考具有较高的光稳定性。
2XR活体成像荧光成像和化学钙传感
我们评估了2XR的NIR-II发射尾在体内的效用。与Cy7相比，皮内注射2XR-1水溶液可以进行更长期的淋巴成像，表明其溶解性好，光稳定性高。此外，制备了葡聚糖- 2XR缀合物，并通过小鼠尾静脉注射给药。NIR-II成像以每秒52.6帧(fps)的速度连续捕获来自心脏、肝脏和膀胱的荧光信号。明亮的荧光甚至能够以25.7 fps的速度监测自由运动小鼠的呼吸动力学。此外，2XR-1和抗PD-L1抗体的分子偶联物显示出对PD-L1(程序性细胞死亡-1配体-1)的高特异性，导致CT-26结肠肿瘤成像在注射后24小时具有高肿瘤与正常组织(T/NT)信号比(18±3.7)。这些结果共同强调了2XR作为荧光剂的体内成像潜力。
2XR-1的优越性能引起了我们对其荧光变体2XR-2的兴趣。在酸性EtOH (0.1% v/v三氟乙酸)中，2XR-2主要采用其荧光两性离子形式，并表现出与2XR-1相似的吸收和发射特性。有趣的是，在吸收中有10 nm的蓝移，导致更大的斯托克斯位移50 nm。虽然确切的机制仍有待完全了解，但这种特性有利于成像，因为它减少了激发干扰。在二氧六环-水混合物中，2XR-2的吸收随介电常数的变化而变化。增加水的分数使平衡从内酯转向两性离子形式。以前的研究使用D50值来描述螺环化平衡状态，其中D50表示介电常数，其中一半的荧光团族以两性离子形式存在。2XR-2的D50为~ 57，与SiRh(64.5)相似，表明具有类似的螺环化平衡。我们评估了2XR-2是否表现出令人满意的蛋白质标记荧光行为。为此，我们合成了2XR-2 HaloTag配体(命名为2XR715HTL)，该配体含有一个氯烷烃连接体，可以靶向并偶联到HaloTag蛋白上。与HaloTag蛋白孵育1小时后，2XR715-HTL的吸光度(720 nm)显著增加105倍，荧光(770 nm)显著增加163倍，而牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)或无HaloTag缓冲液均未见变化，表明2XR715-HTL具有优异的荧光特性。因此，我们评估了其在活细胞成像中的性能。在细胞核中表达组蛋白(H2B)HaloTag融合的HEK293T细胞与2XR715-HTL孵育，在无洗涤条件下成像。在近红外通道(810±45 nm)观察到明亮的核标记，具有高核与胞质信号比(Fnuc/Fcyt = 45)，与DAPI染色的核信号具有良好的共定位。与之前报道的近红外HaloTag配体JF722-HTL相比，2XR715HTL在无洗涤实验中显示出两倍高的Fnuc/Fcyt，尽管其光稳定性较低，需要进一步优化。这些结果表明2XR715-HTL是一种有用的活细胞成像化学标记试剂。
为了证明2XR715-HTL在近红外化学遗传传感方面的潜力，我们使用了具有细胞内钙传感能力的化学遗传指示平台“HaloCaMP1a”HaloCaMP1a最初是用JF635作为底物设计的，我们假设当Ca2+结合诱导传感器结构域的构象变化时，用2XR715-HTL取代JF635会产生近红外信号输出。为了验证这一概念，我们构建了2XR715-HaloCaMP1a混合电路。2XR715-HaloCaMP1a分别在725 nm和760 nm处显示出吸光度和发射峰，荧光在基线上变化很大(ΔF/F0 = 1.7)，对Ca2+具有高亲和力(Kd = 45 nm)。尽管与JF635−HaloCaMP1a相比灵敏度较低(ΔF/F0 = 5.0, Kd = 190 nM， λex/em, max = 640/653 nM)，但36 2XR715-HaloCaMP1a的荧光光谱红移了107 nM。接下来，我们测试了我们的化学Ca2+传感器用于细胞钙成像。用HaloCaMP1a-EGFP质粒瞬时转染HEK293T细胞，然后用2XR715HTL标记，进一步成像，不需要洗涤步骤。在胞浆中观察到明亮的2XR715 - HTL信号和EGFP荧光之间的良好共定位，表明HaloCaMP1a蛋白被有效标记。值得注意的是，在NIR-II区域，胞质与细胞外信号比(Fcyt/Fext = 10.3)仍然很高。然后，我们用100 μM三磷酸腺苷(ATP)处理细胞，诱导细胞内Ca2+振荡在共聚焦显微镜下，胞质荧光反映了Ca2+振荡，平均响应(ΔF/F0)范围在0.1和0.25之间。这些结果表明2XR715-HTL与HaloCaMP1a蛋白之间有很好的匹配。请注意，最初的HaloCaMP生物传感器是使用一系列JF染料作为基础筛选的。我们可以设想，在2XR上进一步的分子工程将导致性能的提高。
2XR715-HTL用于体内HaloTag化学标记
为了验证2XR715-HTL近红外成像的体内性能，我们首先在小鼠消化模型中跟踪了表达halotagg的细菌的运动。在体外对表达halotag的细菌进行特异性标记后，给小鼠灌胃(ig)这些明亮的细菌。体内NIR-II成像清楚地显示了细菌从胃向小肠的迁移。我们在表达halotag的小鼠中评估2XR715-HTL的近红外成像。给小鼠注射rAAV病毒，在皮层神经元中表达HaloTag-mCherry融合蛋白。静脉(i.v)给药2XR715HTL后，表现出与mCherry信号良好的共定位。这表明2XR715-HTL可以穿透血脑屏障，突出其在中枢神经系统中的作用。此外，编码H2B-HaloTag融合的质粒通过尾静脉注入小鼠肝脏。388 h后，静脉注射2XR715HTL。体内NIR-II成像显示，注射后2 h肝脏信号增加2.5倍，而对照组小鼠接受生理盐水后静脉注射染料变化不大，显示组织自身荧光。肝脏切片图像进一步证实了2XR715-HTL对表达h2b - halotag的肝细胞的特异性和稀疏核标记，DAPI染色显示出良好的共定位。总之，这些结果突出了2XR715-HTL在体内化学标记实验中优异的荧光原性和特异性。
总结
我们已经开发出一种新的染料支架，2Xrhodamine (2XR)，可用于制造近红外激发荧光探针，用于体内成像和化学应用。我们的双桥设计增强了发色团结构，实现了近红外波长，增强了亮度，以及适合生物环境的更高KL−Z值。我们已经展示了2XR715-HTL的开发，这是迄今为止最远的HaloTag蛋白红移荧光配体，可以在NIR- II窗口中实现近红外活细胞成像和钙传感以及体内化学遗传标记。我们用荧光2XR715-HTL (log KL−Z =−1.8)的结果表明，它能够穿透血脑屏障，有效地标记表达HaloTag蛋白的神经元。虽然我们没有提供额外的合成例子，但2XR可以作为开发近红外荧光染料的通用设计。2XR光物理的进一步微调可以借鉴罗丹明化学的进展，如光谱调谐、KL−Z调制和亮度优化。此外，双桥核心为探索光物理、荧光性和生物利用度的潜在好处提供了可扩展的结构多样性。我们设想2XR可以在各种基于蛋白质或双正交标记方案中找到广泛的化学应用，或者作为遗传编码荧光适体的配体。
参考文献
2X-Rhodamine: A Bright and Fluorogenic Scaffold for Developing Near-Infrared Chemigenetic Indicators ，Wenxiao Wu, Kui Yan, Zuyang He, Lu Zhang, Yuyao Dong, Bin Wu, Hongyue Liu, Shangfeng Wang,* and Fan Zhang*， J. Am. Chem. Soc. https://doi.org/10.1021/jacs.4c03485
