内容提要
近红外I/II荧光蛋白(NIR-I/II FPs)对体内成像至关重要，但目前的NIR-I/II荧光蛋白面临着包括稀缺性、对发色团成熟的要求以及有限的发射波长(通常< 800 nm)等挑战。在这里，我们利用合成的寻找蛋白质的NIR-II染料作为发色团，通过位点特异性的亲核取代反应与标记蛋白(如人血清白蛋白，HSA)共价结合，从而创造出概念验证的仿生NIR-II FPs。这种化学寻蛋白策略可以在温和的生理条件下完成，无需催化。蛋白质组学分析确定了特异性结合位点(DIII上的Cys 477)。NIR-II FPs可显著提高发色团亮度和光稳定性，同时改善生物相容性，从而实现高性能的NIR-II淋巴造影和血管造影。该策略是通用的，适用于创建广泛的光谱分离NIR-I/II FPs，用于实时可视化多种生物事件。这种简单的仿生方法具有改变基于荧光蛋白的生物成像的潜力，并使原位白蛋白靶向能够创建用于活体深层组织成像的NIRI/II FPs。
实验结果与讨论
我们提出了一种从仿生学角度构建NIR-II FPs的化学选择性寻蛋白策略。我们首先合成了NIR-II蛋白寻找染料(CO-1080)，其最大吸收和发射波长分别为1044 nm和1079 nm。然后选择CO-1080染料作为NIR-II发色团来探索匹配的蛋白质外壳。三种蛋白(β-乳球蛋白(β-LG)、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA))由于其最喜欢的口袋构象以及位点特异性硫醇(-SH)基团而被选择作为蛋白外壳。该口袋可以作为微反应器，在非常温和的条件下(例如，混合)-SH与CO-1080共价结合。具体来说，CO-1080通过超分子相互作用进入蛋白质口袋，通过蛋白质中的-SH基团与CO-1080中的Cl-C键之间的亲核取代反应进行共价结合(我们称之为“寻蛋白策略”)。这种超分子增强工艺导致了CO-1080发色团受到严格限制的超亮仿生NIR-II FPs的产生。在检测的三种蛋白中，HSA@CO-1080 FPs表现出最好的NIR-II发光能力，荧光增强高达22.13倍。
为了更好地了解不同蛋白质与NIR-II发色团的结合机制，我们进行了非共价分子对接模拟。HSA参与结合的氨基酸最多，包括Arg472、Lys475、Thr478、Ser480和Asn483。同时，通过MM/GBSA法计算三种蛋白与CO-1080发色团的对接分数和结合能，发现HSA与CO-1080发色团的对接分数最好，结合能最高，这也解释了为什么HSA对CO-1080染料的发光能力增强效果最大。HSA能有效地限制CO-1080的自由扭转，使非辐射跃迁引起的能量耗散最小化。
接下来，SDS-PAGE凝胶电泳显示BSA@CO1080和HSA@CO-1080 FPs在相应的分子量下都显示出明亮的荧光带，验证了与CO-1080染料的相似且高效的共价结合。凝胶电泳数据表明，β- lg与CO-1080具有一定的共价结合能力，β-LG@CO-1080 FPs在低分子量位置显示出明显的未反应CO-1080条带。高分辨率质谱(HRMS)也证实了CO-1080与相应蛋白之间的共价结合，同时突出了HSA与CO-1080之间的最佳共价结合效率。综上所述，HSA蛋白是CO-1080标记/靶向的最佳候选蛋白，从而获得了稳定且明亮的NIR-II荧光蛋白。
HSA@CO1080 FPs的反应优化及光学性质
NIR-II亮度和凝胶电泳一致验证了反应温度为60℃，反应时间为2 h, HSA与CO-1080的反应比例为1:1的最佳反应条件。为了更好地符合体内成像要求，我们还研究了反应浓度对HSA@CO-1080 FPs发光性能的影响。当HSA和CO-1080的反应浓度超过10 μM时，HSA@CO-1080 FPs的NIR-II荧光信号呈非线性增加，且浓度> 50 μM时存在猝灭效应，未反应的CO-1080染料可见析出。因此，我们采用低反应浓度(10 μM)的超滤浓缩策略制备高浓度NIR-II FPs 。HSA@CO-1080 FPs的大小和形态高度均匀，表明CO-1080发色团安装在HSA空腔中不会影响游离HSA蛋白的结构和形态。我们研究了优化后的HSA@CO-1080 FPs的光学性质， HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激发下的荧光强度最显著，约为980 nm激发下的2.97倍，约为808 nm激发下的20.36倍。HSA@CO-1080 FPs在> 1500nm成像窗口下仍保持发光。荧光光谱和一系列体外穿透实验验证了HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激发下具有显著的NIR-II亮度和穿透深度。此外，通过对比游离CO-1080和HSA@CO-1080水溶液的荧光光谱，有力地证实了仿生FPs策略的有效性，大大提高了CO-1080发色团的NIR-II发光能力，甚至将其成像窗口扩展到> 1500 nm。优异的光稳定性对造影剂的潜在临床应用至关重要。目前，临床批准的吲哚菁绿(ICG)一直受到这个问题的困扰。在HSA@CO-1080 FPs中安装寻蛋白的CO-1080有效地增强了CO-1080染料的光稳定性，没有任何光漂白问题。总之，HSA@CO-1080 FPs令人满意的光稳定性具有很大的临床应用潜力。
仿生NIR-II FPs的发色团优化
为了寻找构建仿生FPs的最佳候选蛋白质NIR-II染料，我们选择了三个1080类似物(Et-1080, Article https://doi.org/10.1038/s41467-024-47063-4 FD-1080, and CO-1080)进行进一步研究。CO-1080染料比Et-1080和FD-1080染料具有更亮的NIR-II亮度。利用密度泛函数理论计算Et-1080、CO-1080和FD-1080染料的最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO) ，结果证实CO-1080染料的带隙最小，为2.9497 eV，具有更大的分子发射红移和更亮的NIR-II荧光。HSA@CO-1080 FPs的NIR-II亮度更明显，约为HSA@Et-1080的3.51倍和HSA@FD-1080的2.72倍。HSA对CO-1080的荧光增强效果高达21.90倍，而对Et-1080和FD-1080的荧光增强效果分别仅为6.72和7.71倍。此外，HSA与Et-1080、CO-1080和FD-1080染料反应后，溶液颜色和紫外吸收/荧光光谱都有不同程度的变化。这说明HSA与1080染料之间的相互作用不同，导致合成的NIR-II FPs具有不同的发光性能。安装HSA前后Et-1080、CO-1080和FD1080的紫外吸收光谱和荧光光谱支持了仿生FPs策略的有效性。这种方法有效地避免了纯染料分子在水溶液中的H或J聚集，显著提高了其NIR-II发射能力。其中HSA@CO-1080 FPs对吸光度和NIR-II荧光发射的改善最为显著。HSA@CO-1080 (> 1100 nm, QYS = 0.0921%)的摩尔消光系数和NIR-II量子产率(QYS)也大大高于HSA@Et-1080和HSA@FD-1080。
HSA与一系列1080发色团的结合域分析
在确定了仿生NIR-II FPs的最佳构建方案后，我们进一步详细探讨了HSA与1080发色团之间的特异性结合域。已知HSA由三个结构域组成，即结构域I (DI)、结构域II (DII)和结构域III (DIII)。因此，重组DI、DII和DIII蛋白与一系列1080个发色团反应，以探索与不同发色团相关的特定结构域。NIR-II荧光、SDS-PAGE凝胶电泳和HRMS一致表明，无论是Et-1080、CO1080还是FD-1080染料，它们都与DIII共价相互作用。CO1080和DIII具有高效的共价结合能力，结合率高达97.27%，几乎没有检测到纯蛋白峰。Et-1080和FD-1080与DIII的共价结合能力不理想，结合率分别为34.34%和15.12%。由此可知，1080染料与HSA的共价结合位点位于DIII上，再次确认了CO-1080是与HSA匹配最有效的发光中心。受我们之前报道的含氯的菁氨酸染料可以通过亲核取代与白蛋白的半胱氨酸(Cys)残基共价结合的启发，我们选择l -半胱氨酸盐酸盐分子作为HSA的Cys残基替代品，并试图在碱催化剂条件下，通过在Cys残基上巯基取代1080染料上的氯来验证共价的形成。相应反应产物的液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)表征成功地证明了l -半胱氨酸的巯基可以通过亲核取代与环己烯环唯一碳上的中氯发生反应。需要强调的是，上述置换反应的成功在很大程度上依赖于碱催化剂和过量的l -半胱氨酸分子(反应比例为10:1)的加入。同时，cys阻断的CO-1080不能与HSA共价结合。为了更好地模拟和理解蛋白质溶液中的反应，我们还在不添加其他添加剂的情况下进行了CO-1080与Cys的等效反应。LC-HRMS结果显示CO-1080和Cys之间几乎没有亲核取代。在温和的PBS缓冲条件下，CO-1080和HSA之间的介氯位移可以完成，我们的蛋白质寻找方法解释了HSA的DIII结构域作为微反应器，通过有效调节CO-1080染料构象触发无催化的亲核取代。
HSA@CO-1080 FPs的NIR-II淋巴造影和血管造影
考虑到其潜在的临床应用，有必要对HSA@CO-1080 FPs的生物安全性进行评价。我们首先评估了CO-1080发色团和HSA@CO-1080 FPs的血液安全性。结果证实，即使在高共孵育浓度(200 μM)下，CO-1080发色团和HSA@CO1080 FPs的溶血作用也可以忽略不计，远远优于ICG。使用成纤维细胞(L929)和乳腺癌细胞(4T1)类型进一步评估细胞毒性，即使在200 μM的HSA@CO1080共孵育浓度下也没有观察到明显的细胞毒性。相比之下，CO-1080发色团在30 μM的共孵育浓度下显示出明显的细胞毒性，突出了仿生FPs策略改善染料生物相容性的合理性和优势。在体外建立了良好的生物安全性之后，我们通过将HSA@CO-1080 FPs静脉注射到小鼠体内来评估其生物毒性。所有生化指标均在正常值范围内，未发现明显的急性/慢性机体损伤。快速和可控的药代动力学以及成像后主要器官造影剂的最小积累对临床翻译至关重要。CO-1080发色团和HSA@CO-1080 FPs在尾静脉注射后器官蓄积量相对较低，注射后7天内可完全排出体外。值得注意的是，与CO-1080相比，HSA@CO-1080 FPs在短期内表现出更突出的体内分布和成像能力。
在生物医学应用中，可靠的淋巴/血管系统可视化对于评估功能和监测再生能力至关重要。目前，虽然ICG淋巴造影已用于临床影像学，但其成像窗口仍停留在NIR- i区或NIR- ii窗口有限，导致穿透深度和分辨率有限，严重制约了近红外荧光成像技术的充分发挥潜力。为了解决这些局限性，我们研究了HSA@CO-1080 FPs进行NIR-II淋巴造影的能力。HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激发下显示出更优越的淋巴结定位和淋巴管描绘，优于自由的CO-1080发色团。值得注意的是，HSA@CO-1080 FPs在> 1500 nm成像窗口保持了优异的淋巴成像能力，从而提高了淋巴系统的成像质量(Supplementary )。HSA@CO-1080与临床ICG相比，FPs也显示出明显优越的NIR-II淋巴成像能力和更长的时间窗口。然后成功地将NIR-II FPs应用于图像引导的淋巴结精确解剖和淋巴水肿疾病的高质量可视化。综上所述，HSA@CO-1080 FPs是下一代NIR-II淋巴造影的主要候选者，解决了临床ICG淋巴造影的缺陷/局限性。
血管对输送营养物质和维持全身器官的正常功能至关重要。高质量的血管造影可以帮助外科医生更有效地识别各器官的血管病变，并评估术后血流恢复情况46,47。因此，我们对HSA@CO-1080 FPs进行了一系列临床前血管造影研究。与CO-1080发色团相比，HSA@CO-1080 FPs显示出优越的全身和局部(腿部)血管NIR-II成像能力。将成像窗口移动到更长的波长进一步提高了成像质量，特别是在> 1400 nm和> 1500 nm成像窗口，几乎没有皮肤/背景信号干扰。此外，1064 nm激发获得了更突出的组织穿透深度和空间分辨率，进一步突出了HSA@CO-1080 FPs相对于CO-1080染料的优势。在成像过程中，我们观察到静脉注射HSA@CO-1080 FPs后，静脉和动脉可以清晰地追踪和区分。定量荧光信号可以观察到动脉内的流速和呼吸频率。HSA@CO-1080 FPs也成功应用于相对较大的哺乳动物(包括大鼠和兔子)的高精度血管成像(Supplementary )。此外，HSA@CO-1080 FPs的血半衰期和血管造影时间窗。上述结果一致表明HSA@CO-1080 FPs具有快速的血液清除率，在静脉注射后约10 min，相应血管的荧光可以忽略不计。值得注意的是，由于染料和白蛋白在体内的潜在酶降解和/或解离，估计HSA@CO-1080 FPs的总排泄是具有挑战性的。补充图显示了HSA@CO-1080 FPs的重复血管成像能力的调查。正如预期的那样，HSA@CO-1080 FPs可以在不受皮肤信号明显干扰的情况下实现对血管的多重/长期监测，这也充分证实了HSA@CO1080 FPs长期检测/追踪血管相关疾病的能力。
仿生NIR-I/II FPs多色体内成像
由于生物体的复杂性和动态性，静态的单源信号采集无法提供生物生理、病理变化的全貌。实时多通道NIR-I/II成像系统可同时记录多个事件，可深入了解疾病发生机制，提高成像效率，具有较高的体内和临床适用性。多种生物事件的综合荧光成像依赖于非串扰荧光探针。为了验证NIR-I/II FPs用于多色生物成像的可行性，我们还选择了NIR-I寻蛋白染料，并成功构建了仿生NIR-I FPs (HSA@IR-808和β-LG@IR-780)，并将其与NIR-II FPs (HSA@CO-1080和DIII@CO-1080)结合。合成的NIR-I和NIR-II FPs分别在808 nm和1064 nm激发下实现了非重叠发射，具有优异的双色成像电位。不同激光激发下的紫外吸收和荧光数据进一步证实了使用NIR-I和NIR-II FPs进行双色生物成像的可行性。随后，我们使用NIR-I和NIR-II FPs进行了一系列体内多通道生物成像实验。首先，利用HSA@IR-808 FPs和HSA@CO1080 FPs成功实现了多通道NIR-II淋巴成像。这些NIR-I/II FPs成功地实现了肿瘤浸润前哨淋巴结的精确共定位，从而指导术中有效的手术切除(避免不必要的切除)。使用HSA@IR-808 FPs和HSA@CO-1080 FPs也实现了血管和淋巴系统无干扰的综合NIRII生物成像，这对精确成像指导手术很重要。结合HSA@CO-1080 FPs(肝胆排泄)和β-LG@IR-780 FPs(肾排泄)，可以同时显示两种药代动力学途径，没有串扰问题。综上所述，基于仿生策略构建的nir - 1 /II荧光蛋白具有良好的多色生物成像应用潜力，有望实现多种生物事件的实时集成成像，更好地协助临床医生处理复杂疾病。
结论
在这项工作中，我们设计并提出了一种具有NIR-II峰值发射的仿生荧光蛋白系统，该系统结合了有机荧光团和蛋白质标签的优点。我们将化学性寻蛋白NIR-II染料(CO-1080)作为发色团，它可以通过亲核取代反应自动共价标记到结构合适的蛋白质(例如，HSA)上，形成NIR-II FPs (HSA@CO-1080)。与传统的基因编码构建策略不同，HSA和NIR-II发色团只需要简单的混合加热过程就可以完成FPs的构建。我们进行了一系列的体外实验，证明了这种寻蛋白策略在显着提高发色团的亮度、光稳定性和生物相容性方面的有效性。因此，该方法可实现高性能的NIR-II淋巴造影术(如诊断淋巴水肿疾病)和血管造影术(如监测皮瓣功能)。
参考文献
Biomimetic NIR-II fluorescent proteins created from chemogenic protein-seeking dyes for multicolor deep-tissue bioimaging，Jiajun Xu, Ningning Zhu, Yijing Du, Tianyang Han, Xue Zheng, Jia Li1 & Shoujun Zhu*，Nat. Commun. | (2024) 15:2845 https://doi.org/10.1038/s41467-024-47063-4
