内容提要
最近猴痘的流行已导致宣布国际关注的突发公共卫生事件。目前，缺乏有效的猴痘临床治疗方法，阻断病毒传播的策略也充满了缺陷。本研究构建了一个仿生纳米模板(称为TBD@M NPs)，以巨噬细胞膜为涂层，聚合纳米颗粒装载以光热分子TPE-BT-DPTQ为核心的多功能聚集诱导发射。在猴痘代理小鼠模型(牛痘病毒感染的尾巴划痕模型)中，静脉注射TBD@M NPs显示出病变的精确跟踪和近红外区II荧光成像。808 nm激光照射后，病毒被光热效应消灭，感染创面迅速愈合。更重要的是，接种处理过的病变组织悬浮液不会引发健康小鼠的尾部感染或炎症激活，表明成功阻断了病毒传播。本研究首次证明了纳米医学在猴痘治疗中的应用，并可能为在临床试验中开发可行的猴痘管理策略带来新的见解。
实验结果与讨论
TPE-BT-DPTQ和TBD@M NPs的合成与表征
在本研究中，将高性能AIE分子TPE-BT-DPTQ(图1A)加载到PLGA核心中，然后通过巨噬细胞膜涂层形成具有病毒靶向、NIR-II FLI和光热转换功能的多功能仿生纳米颗粒(TBD@M NPs)。TPE-BT-DPTQ以6,7-二苯基-[1,2,5]噻二唑[3,4-g]喹诺啉(DPTQ)为分子骨架，以苯并[c]噻吩(BT)为电子给体/-bridges，四苯基(TPE)段为两侧的马达或电子屏蔽部分合成。事实上，DPTQ主链作为一个强电子受体，而TPE部分和位阻BT共同作为一个增强的电子给体基团。根据TPE-BT-DPTQ的最高已占据分子轨道(HOMO，−4.57 eV)和最低未占据分子轨道(LUMO，−3.06 eV)的理论能级，计算出TPE-BT-DPTQ的能隙(∆E)为1.51 eV。TPE-BT-DPTQ溶解在四氢呋喃(THF)中的最大紫外-可见吸收峰为≈821 nm，光致发光(PL)光谱峰值为≈1121 nm。值得注意的是，其荧光波长位于NIR-II区(>1000 nm)，这是猴痘病变NIR-II FLI的一个有希望的特征。随后，通过检测TPE-BT-DPTQ在不同H2O组分的THF-H2O混合物中的荧光强度来确定其AIE倾向。由于分子内电荷转移(TICT)扭曲态的形成，当H2O的比例从0%变化到40%时，荧光强度开始减弱，而进一步增加H2O的比例，荧光强度增强，显示出强大的AIE趋势。从机理上讲，TPE-BT-DPTQ在良好的溶剂THF中是非发射或弱发射的，这是由于周围苯环的主动旋转或振动，这是激发态非辐射衰减到基态的松弛通道。然而，在THF溶液中加入H2O(弱溶剂)形成聚集后，这种分子内运动受到分子间位阻(又称分子内运动限制[RIM])的限制，阻断了无辐射弛豫通道，打开了辐射途径。然后制备了负载TPE-BT-DPTQ的TBD@M NPs。总之，首先通过低渗裂解、机械破碎和密度梯度超离心提取巨噬细胞膜。同时，将TPE-BT-DPTQ装载到PLGA聚合物中，通过标准的纳米沉淀步骤形成PLGA芯。最后，将巨噬细胞膜和PLGA芯混合并通过200 nm聚碳酸酯过滤器共挤压，从而将巨噬细胞膜涂覆在PLGA芯上形成TBD@M纳米泡。为了进行比较，制备了巨噬细胞膜衍生的纳米泡(mnvs)作为对照。通过动态光散射(DLS)分析，膜涂层后NPs的粒径从109.4 nm (PLGA芯)增加到121.9 nm (TBD@M NPs)，表明细胞膜双分子层(≈12.5 nm)成功添加到PLGA芯上。表面电位从- 43.8 mV变化到- 32.6 mV(与M NVs相同)，代表巨噬细胞膜的表面电荷。透射电镜(TEM)显示，与裸露的PLGA核相比，TBD@M NPs结构为典型的球形核-壳形态，表明巨噬细胞膜成功涂覆在PLGA核表面。此外，TBD@M NPs在PBS和血清中保存7天后，粒径高度稳定。
TBD@M NPs的光热性质研究
我们全面研究了TBD@M NPs的光热特性。与PBS相比，TBD@M NP悬浮液在808 nm激光照射后表现出较强的光热转换效应，与传统光热剂吲哚菁绿(ICG)相似。具体而言，根据相关公式计算，TBD@M纳米粒子的光热转换效率为39.3%，远高于其他常用的商用光热剂，如金纳米棒(21%)和金纳米壳(13%)。在808 nm激光照射下，TBD@M NPs的温度分布呈现出明显的浓度依赖性和激光功率依赖性增量。值得注意的是，在功率为0.4 W cm-2的808 nm激光照射7 min内，TBD@M NP悬浮液(2.0 mg mL−1蛋白浓度)温度达到约70℃，有利于猴痘病毒的光热根除。相反，未加载TPE-BT-DPTQ分子的PLGA NPs (600 μg mL−1)和PLGA@M NPs (2.0 mg mL−1蛋白浓度)在相同的激光照射(0.4 W cm-2)下没有表现出明显的温度升高，这表明TBD@M NPs的光热功能确实来自于封装AIE光热剂TPE-BT-DPTQ，而它们的基质几乎没有光热效应。在808 nm激光照射下，TBD@M NPs经过8个连续的加热-冷却循环后，其光热效应得以保持，而在相同的激光条件下，ICG的光热行为受到了明显的阻碍，这表明TBD@M NPs具有很强的光热稳定性。高功率808 nm激光(0.8 W cm−2)连续照射后，TBD@M NPs的吸光度光谱几乎没有变化，说明TBD@M NPs在强激光照射下没有降解，而ICG的吸光度明显下降。此外，在持续强激光照射下，TBD@M NP悬浮液的颜色保持不变，而ICG溶液的外观发生了明显变化。另一方面，考虑到TBD@M NPs具有NIR-II FLI功能(来自封装的TPE-BT-DPTQ分子)，我们研究了这些纳米复合物抵抗光漂白的能力，因为这种光学性质决定了它们在生物成像中的作用。在808 nm激光(0.4 W cm−2)持续照射下进行光漂白实验。每分钟检测TBD@M NP悬液(2.0 mg mL−1蛋白浓度)的荧光强度。用激光照射前(0 min)初始荧光强度归一化，计算不同照射时间后荧光强度的百分比。作为对照，ICG在808 nm激光激发下也能发出荧光。即使在808 nm激光连续照射20 min后，TBD@M NP悬液的荧光信号仍然很强(衰减约26.8%)。相比之下，在相同的激光条件下，ICG溶液(0.2 mg mL−1)的荧光强度下降到97.5%以上。结果表明，TBD@M NPs具有极其优异的热稳定性和光稳定性，可作为猴痘长期FLI和有效光热治疗的高性能造影剂和光热剂。通过细胞膜包被，TBD@M NPs继承了巨噬细胞来源的关键蛋白受体和生物学特性。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测PLGA核、M膜、M NVs、TBD@M NPs和巨噬细胞裂解液的蛋白质谱显示，TBD@M NPs的蛋白质成分与M膜和M NVs相似，但与细胞裂解液(含有细胞内蛋白质)不同，表明只有细胞膜成分被包裹在TBD@M NPs上。此外，western blot分析表明TBD@M NPs保存了巨噬细胞特异性膜蛋白，如CD14、甘露糖受体(CD206)和CCR2。通常，与整个细胞裂解液相比，膜提取和涂覆在PLGA核心上形成TBD@M NPs的过程促进了这些分子显著的蛋白质富集。
体外病毒靶向、抗病毒和抗炎活性
将TBD@M NPs特异靶向猴痘病毒，不仅可以增强其光热抗病毒作用，还可以减少NPs对周围正常组织的副作用。因此，我们首先研究了巨噬细胞膜和TBD@M NPs对猴痘病毒的特异性结合能力。由于猴痘病毒对人类危害极大，必须在生物安全三级实验室进行处理，我们从正痘病毒属引入了一种密切相关的牛痘病毒作为替代病毒。gfp -痘苗病毒与巨噬细胞共孵育仅2分钟后，就迅速结合到巨噬细胞膜表面，说明痘苗病毒与巨噬细胞膜的结合能力很强。此外，gfp -痘苗病毒共孵育10 min后可与TBD@M NPs结合，直接证实TBD@M NPs对痘苗病毒颗粒的靶向作用。为了探索激光诱导TBD@M NPs的抗病毒能力，将牛痘病毒与PBS、PLGA核(基于TPE-BT-DPTQ分子的60 μg mL - 1)、TBD@RBC NPs (2.0 mg mL - 1蛋白浓度)或TBD@M NPs (2.0 mg mL - 1蛋白浓度)共孵育30分钟，随后有或没有808 nm激光(0.4 W cm - 2)照射8分钟。然后，通过50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定不同处理后的残留活病毒滴度。值得注意的是，我们引入了TBD@RBC NPs作为重要对照，该NPs是用RBC膜作为涂层和负载TPE-BT-DPTQ为核心的PLGA核制备的。具体而言，TBD@RBC NPs与TBD@M NPs类似，表现出典型的核壳结构，但其表面不携带巨噬细胞相关受体，如CD14、CD206和CCR2。因此，从理论上讲，TBD@RBC NPs与TBD@M NPs不同，它们不能通过趋化性精确靶向猴痘的特征病灶，也不能通过特异性受体-配体结合实现猴痘病毒靶向。如图3C所示，在没有808 nm激光刺激的情况下，不同药物对牛痘病毒几乎没有杀伤作用。在808 nm激光照射下，PBS组仍无抗病毒作用，而PLGA核心和TBD@RBC NPs组有一定的病毒消除作用，这归因于负载AIE光热分子TPE-BT-DPTQ的作用。更重要的是，“TBD@M NPs +激光”治疗由于NPs对病毒的特异性靶向，几乎根除了病毒，从而增强了其光热杀病毒效果。不同预处理的牛痘病毒感染宿主细胞(BHK-21) 12 h后，“无激光”组和“PBS +激光”组细胞病变明显，细胞活力下降。相比之下，激光照射的PLGA核和TBD@RBC NPs对细胞有一定的保护作用，而“TBD@M NPs +激光”组完全抑制宿主细胞死亡。另一方面，“TBD@M NPs +激光”预处理的牛痘病毒与巨噬细胞共孵生，未诱导多种促炎因子(IL-1、IL-6、G-CSF)过表达，证实了其抗炎作用。
体内病灶追踪、抗病毒和伤口愈合促进活动
我们建立了牛痘病毒感染的尾巴划痕小鼠模型作为猴痘的替代模型，以模拟猴痘的特征性脓疱病变。值得注意的是，据报道，牛痘病毒的尾巴划伤可作为评估天花疫苗效力的小鼠模型。采用划伤技术将牛痘病毒接种到小鼠尾部7天后，尾部创口产生大量结痂，表明该病毒在原位持续复制并引发剧烈的炎症反应。在牛痘病毒感染小鼠中静脉注射200 μL PBS、PLGA核心(基于AIE分子100 μg kg - 1)、TBD@RBC NPs (20 mg kg - 1蛋白浓度)或TBD@M NPs (20 mg kg - 1蛋白浓度)后，与PBS组相比，PLGA核心、TBD@RBC NPs和TBD@M NPs组在注射后6-72 h均显示出尾部病变的靶向NIR-II FLI。这归因于负载AIE分子的NIR-II荧光特性和病变的EPR效应。特别是，TBD@M NPs组在感染灶上表现出更高的荧光强度和更长的停留时间，甚至超过72小时，可能是由于TBD@M NPs能够特异性地与病毒结合。我们系统地评估了TBD@M NPs的靶向抗病毒、抗炎和伤口修复作用。经静脉注射PBS、PLGA核心(基于AIE分子100 μg kg −1)、TBD@RBC NPs (20 mg kg −1蛋白浓度)或TBD@M NPs (20 mg kg −1蛋白浓度)后，未进行后续激光照射，病毒感染小鼠的尾部病变未得到改善，且保留了大量结痂。在808 nm激光(0.4 W cm−2)照射10 min后，PLGA核心和TBD@RBC NPs组显示出一定的创面修复潜力，而TBD@M NP处理显著促进结痂消融和创面愈合。从不同处理的尾部病变分离的结痂重量也表明，“PLGA核+激光”和“TBD@RBC NPs+激光”治疗在一定程度上促进了感染性结痂的消融，而“TBD@M NPs+激光”组结痂几乎被根除。此外，检测尾部病变组织中的牛痘病毒滴度显示，TBD@M NP治疗后，808 nm激光照射与其他组相比，几乎根除了病毒。为了评估不同处理对病毒的清除能力，7天后采集尾病变组织，切片进行牛痘病毒抗原免疫组化(IHC)染色。在没有后续照射的情况下，所有组都显示出极高的病毒抗原阳性免疫组化密度。相比之下，与PBS组相比，随后接受808 nm激光照射的PLGA核心、TBD@RBC NPs和TBD@M NPs治疗组的病毒抗原阳性免疫组化密度显著降低。通常情况下，后一种疗法会去除所有的病毒抗原。苏木精-伊红(HE)染色分析显示，未激光照射组和PBS +激光照射组尾病变组织均存在广泛的炎症细胞浸润和大面积坏死。PLGA芯线和TBD@RBC NPs结合808 nm激光(0.4 W cm−2)照明可略微降低组织坏死程度，而“TBD@M NPs +激光”方案可显著缓解组织坏死和过度炎症浸润，并恢复受损的表皮层。随后，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同处理后尾病变组织中IL-1、IL-6、TNF-时延、IFN <s:2>等促炎因子的浓度。在808 nm激光照射或不照射PBS组中，尾部病变组织中这些促炎细胞因子的水平非常高，表明牛痘病毒感染引发了强烈的炎症反应。单独给药不同的药物(PLGA核心、TBD@RBC NPs和TBD@M NPs)并没有引起这些促炎细胞因子浓度的降低，这表明所有“无激光”组都没有抗炎作用。当引入808 nm激光时，PLGA核心和TBD@RBC NPs治疗均导致这些促炎细胞因子水平适度降低，而“TBD@M NPs +激光”方案显示出极强的抗炎活性。这种清除病毒、抗炎和修复伤口的作用充分展示了“TBD@M NPs +激光”治疗猴痘策略的抗病毒和皮肤美化潜力。
TBD@M NPs +激光”方案有效阻断病毒传播
我们系统地评估了图中描述的不同治疗策略(PBS、PLGA核心、TBD@RBC NPs或TBD@M NPs，有或没有808 nm激光刺激)有效阻止病毒从尾部病变传播到健康小鼠的能力。将等重的不同处理的尾部病变组织分离、研磨、重悬于相同体积的PBS中，然后通过划伤手法重新接种到健康小鼠的尾部。7 d后记录尾貌，检测尾病变组织中牛痘病毒载量，测定尾病变组织中促炎细胞因子水平。如图5A所示，将所有“无激光”组和“PBS +激光”组的组织稀释液重新接种，在健康小鼠中引发了严重的尾部感染和结痂，表明痘苗病毒成功传播。相比之下，“PLGA核心+激光”和“TBD@RBC NPs +激光”组的组织坏死水平轻度降低，“TBD@M NPs +激光”组对健康尾巴几乎没有损伤。再接种尾病变组织的牛痘病毒滴度检测显示，“无激光”和“PBS +激光”组的病毒载量都很高，而“PLGA核心+激光”和“TBD@RBC NPs +激光”组的病毒载量相对较低。值得注意的是，在“TBD@M NPs +激光”组的尾部病变组织中检测到很少的活病毒，这表明该方案有效地阻断了病毒的传播。随后的ELISA检测显示，未激光照射组和“PBS +激光”组的尾病变组织有强烈的炎症激活，大量释放各种促炎细胞因子，包括il - 1、IL-6、TNF- rr和IFN- <s:2>。相比之下，“PLGA核心+激光”和“TBD@RBC NPs +激光”组中检测到适度的促炎细胞因子表达，而“TBD@M NPs +激光”组在健康尾中几乎没有引起炎症。此外，再孵育尾部病变组织的组织病理学分析(HE染色)显示，在没有激光照射的所有组以及“PBS +激光”组中，炎症细胞浸润过多，广泛坏死。相反，PLGA核和TBD@RBC NPs联合808 nm激光(0.4 W cm−2)照射可明显改善组织坏死水平，促进修复细胞增殖，但不能有效缓解过度炎症浸润。更重要的是，“TBD@M NPs +激光”策略可以同步有效地消除坏死组织和炎症细胞，使受损表皮得以修复。总体而言，我们的研究结果表明，“TBD@M NPs +激光”治疗方案在治疗猴痘和促进人类皮肤美化以及阻断病毒向健康人群传播方面具有巨大潜力。
总结
成功研制了一种基于AIE分子的巨噬细胞样仿生纳米粒子(TBD@M NPs)，具有病变和病毒双靶向、NIR-II荧光发射和光热特性，可用于猴痘的综合治理。在猴痘代理小鼠模型中静脉注射后，TBD@M NPs可以长时间追踪病毒感染的病灶。在808 nm激光刺激下，TBD@M NPs促进了NIR-II损伤的高效FLI和光热病毒的消除，以及感染伤口的快速愈合。这些发现是关于纳米材料用于治疗和预防猴痘的第一份报告，将为猴痘管理开辟新的视角，并引发猴痘治疗学的最新发展。
参考文献
Aggregation-Induced Emission-Based Macrophage-Like Nanoparticles for Targeted Photothermal Therapy and Virus Transmission Blockage in Monkeypox， Bin Li, Wei Wang, Lu Zhao, Mengjun Li, Dingyuan Yan, Xiaoxue Li, Jie Zhang, Qiuxia Gao, Yi Feng, Judun Zheng, Bowen Shu, Yan Yan, Jiamei Wang, Huanhuan Wang, Lingjie He, Yunxia Wu, Sitong Zhou, Xinchi Qin, Wentao Chen, Kaizhen Qiu, Chenguang Shen,* Dong Wang,* Ben Zhong Tang,* and Yuhui Liao*， Adv. Mater. 2024, 36, 2305378， https://doi.org/10.1002/adma.202305378
