内容提要
本文提出一种通过放大分子内低频振动和增强推拉效应来构建PAI造影剂的简便高效策略。基于硼-二吡咯亚甲基（BODIPY）骨架，我们以此混合策略构建了造影剂BDP1-NEt2。与光声研究中广泛使用的FDA批准有机染料吲哚菁绿（ICG）相比，BDP1-NEt2的紫外/可见-近红外吸收峰位于825 nm，具有更优的活体光声信号强度和卓越的稳定性，可显著提升肿瘤诊断效果。
Bodipy染料的设计和合成
硼-二吡咯（Bodipy）染料的出色光稳定性和大的消光系数，是开发PAI试剂的理想支架。然而，BODIPY染料以其高荧光量子产率(FQY)而闻名。荧光来自辐射衰变，而PA效应与非辐射衰变有关。考虑到这些相互竞争的能量耗散途径，用PA信号压倒荧光的策略仍然难以实现。提高PA信号的关键是启用非辐射衰减过程。 主动分子内运动（例如旋转和曲折）有助于通过非辐射途径释放激发能。我们选择了中位三氟甲基BODIPY作为支架。Meso-CF3基团与相邻的两个甲基基团之间的强烈空间斥力导致BODIPY支架发生较大的弯曲，尤其是在激发态。这种弯曲有效地激活了分子内的低频振动，并显著促进了PA效应。据我们所知，该设计代表了PAI试剂优化的第一个范例，即通过分子内低频振动加速非辐射过程。通过将给电子基团（即二乙胺）引入meso-trifluoromethylBODIPY支架，进一步增强了PAI剂吸收中的非辐射衰变和深变色位移。增强的推挽效应最小化了光学间隙（如大红移所反映的），从而大大加速了非辐射衰变（能隙定律）。结合强烈的分子内低频振动和强推挽效应，我们开发了一种基于BODIPY的高对比度PAI剂，BDP1-NEt2。该剂表现出理想的NIR吸收、强大的PA信号和出色的光稳定性。由于这些优点，BDP1-NEt2在体内表现出良好的PA信号强度和稳定性，用于肿瘤诊断。我们在中三氟甲基BODIPYs中引入了两个侧翼甲基基团，以增强其空间位阻并增加结构弯曲，作为参考，还合成了不含甲基的meso-trifluoromethyl BODIPYs（即BDP2-CO2Me和BDP2-NEt2）。
结构弯曲诱导的分子内低频振动
由于介观CF3基团周围引入相邻甲基引起的大空间位阻，BDP1-CO2Me（α=157.4°）和BDP1-NEt2（α=157.8°）的优化几何形状比BDP2-CO2 Me（α=174.6°）和BDP2NEt2（α=169.2°）表现出更显著的弯曲。在光激发下，与基态相比，BDP1-CO2Me和BDP1-NEt2的二面角进一步减小。我们的计算结果表明，由于分子内电荷转移，介观取代基和荧光团支架之间的C- C键在激发态获得了更多的双键特征，相应的键长也变得更短。C- C键的这种缩短将进一步增强空间排斥，从而加强结构弯曲。这种结构弯曲显著促进了分子内低频振动。为了深入了解详细的振动模式，计算了BDP1-CO2 Me、BDP1-NEt2、BDP2-CO2Me和BDP2NEt2的重组能量，作为正常模式波数的函数。值得注意的是，由于低频振动模式的热可及性，此类模式对总重组能量的巨大贡献通常导致高非辐射率。主要研究了BDP1-CO2 Me、BDP1-NEt2、BDP2-CO2Me和BDP1NEt2中分子内低频振动的贡献。 如图2B所示，BDP1-CO2 Me和BDP1-NEt2的低频振动模式对其总重组能有显著贡献，分别注册为15.1%和19.2%。相比之下，BDP2-CO2 Me和BDP2-NEt2的低频振动贡献分别急剧下降至5.7%和7.0%。这些结果表明，通过增加空间位阻来增强结构弯曲可以有效促进分子内低频振动。此外，先前报道的荧光团（C-102、C-153、KFL-2和KFL-4，方案S4）表明平面支架在低频振动方面存在缺陷（<9%）。这些结果共同支持了我们的说法，即结构弯曲与低频振动密切相关。
高效低频振动促进光热转换
溶液中没有看到每种化合物聚集的证据，表明单体状态BDP2-CO2 Me（ΦF=72.0%）的荧光比BDP1-CO2Me（ΦF=9.2%）亮得多，尽管它们具有相似的吸收。BDP2-NEt2和BDP1-NEt2之间也观察到这种荧光量子产率的差异。BDP1-CO2 Me和BDP1-NEt2中的辐射衰减（例如荧光）被严重抑制，这是由于有效的低频振动引起的放大的非辐射衰减。我们评估了BDP1-CO2 Me、BDP1-NEt2、BDP2-CO2Me和BDP2-NEt2的光热转换。图中显示，用808 nm激光（1.0 W/cm2）照射6 min后，BDP1-NEt2溶液的温度升高到64.6°C，比BDP2-NEt2高8°C。此外，如公式S2所定义，BDP1-NEt2的PCE（η）计算为41.7%，比BDP2-NEt2高1.5倍（~29.6%）。 在660 nm激光（1.0 W/cm2）照射6分钟后，BDP1CO2 Me和BDP2-CO2 Me之间也观察到显著的温差（~3.4℃），BDP1-CO2 Me的PCE（~17.5%）比BDP2-CO2Me的PCE（~9.2%）高出约2.4倍。此外，在PBS缓冲液中，BDP1-NEt2（BDP1-CO2 Me）和BDP2-NEt2（BDP2-CO2 Me）之间记录了类似的光热转换差异，即使可能会发生轻微聚集。 相对于BDP2-NEt2（BDP2-CO2Me），BDP1-NEt2（BDP1-CO2 Me）的高光热转换能力与低频振动引起的更有效的非辐射衰减一致。这些结果有力支持通过增加支架弯曲从而激活分子内低频振动来增强光热转换的可行且有效的策略。
拉效应的影响
我们在我们弯曲的BODIPY支架中分别引入了碳甲氧基和二乙氨基作为electron-withdrawing基团（EWG）和给电子基团（EDG）。此外，制备了BDP1-H。比较这些化合物的PCE使我们能够探索推挽效应的影响。电荷转移距离（dCT，在HOMO-LUMO跃迁期间）可以用来反映推挽效应。dCT值在真空和水中都进行了计算。与BDP1-H和BDP1-CO2 Me相比，BDP1-NEt2表现出较大的dCT（真空中约为2.544埃；水中约为3.112埃），通过EDG取代证明了强大的推拉效应。此外，计算表明，BDP1-NEt2还显示出比BDP1-CO2 Me（1.95 eV）和BDP1-H（1.98 eV）更小的光隙（发射能量，真空中为1.82 eV）。 BDP1-NEt2的小光学间隙可以有效地促进非辐射衰变（能隙定律）。实验结果表明BDP1-NEt2表现出最长的峰值UV/Vis-NIR吸收和发射波长。BDP1-NEt2的NIR吸收（~825 nm）是PAI的理想选择。有趣的是，低频振动对BDP1-H重组能的贡献（~20.7%）与BDP1-NEt2（~19.2%）相当。然而，BDP1-NEt2的光热转换效果优于BDP1-H。BDP1-NEt2的PCE（~41.7%）几乎是BDP1-H（~21.0%）的两倍。 这些差异表明，除了低频振动之外，BDP1-NEt2中的强推拉效应成功地加速了非辐射衰变。因此，增强推拉效应也可能是提高PA性能的有效方法。
体外PA反应
BDP1-NEt2在3.9至500.0μM的浓度范围内表现出最强的PA信号。即使在低浓度（~3.9μM）下，BDP1-NEt2仍然显示出高PA强度。值得注意的是，在62.5μM的浓度下，BDP1- NEt2的PA强度比ICG高4倍以上，这表明其在临床PAI研究中的潜力。 BDP1-NEt2的PA光谱，与其吸收光谱密切匹配，表明PA信号起源于NIR窗口中的光子吸收。此外，BDP1-NEt2的PA幅度与浓度表现出很强的线性关系，表明定量分析的巨大潜力。此外，为了模拟生理环境，我们进一步测量了磷酸缓冲盐水（PBS）、含PBS血清和含PBS血浆中每种药物的PA信号。虽然所有药物的PA信号都有所下降，但BDP1-NEt2仍然表现出相对较强的PA信号，展示了其在体内PA成像的潜力。BDP1-NEt2的无重原子特性导致1O2的产生可以忽略不计，正如基于标准9,10蒽二酰基双（亚甲基）-二丙二酸（ABDA）的测定所证实的那样。我们因此得出结论，在BODIPY支架中有效的分子内低频振动和强推拉效应的结合可以设计出具有扩展吸收、强PA信号发射和优异光稳定性的高对比度PAI试剂（例如BDP1-NEt2）。
体内PA成像
为了进一步挖掘BDP1-NEt2的PAI潜力，在荷瘤小鼠模型中进行了体内PAI实验。首先，将小鼠分成两组。分别通过瘤内注射（i. t.）将BDP1-NEt2和ICG注射到这两组小鼠体内。随后在770和820nm光激发下24小时内使用PAI。BDP1-NEt2处理的小鼠发出的PA信号明显强于ICG处理的小鼠（>4倍）。这与体外结果一致，表明BDP1-NEt2即使在复杂的肿瘤微环境中也具有优越的PA效果。我们接下来计算了不同时间点（0、1、3、6、9、12和24小时）的归一化PA强度。 ICG治疗组的PA信号在注射后2小时达到最大值；BDP1-NEt2治疗组仅需要大约1小时即可获得最大PA信号。这项研究展示了BDP1-NEt2在快速肿瘤诊断方面的潜力。此外，与ICG相比，BDP1-NEt2表现出优异的稳定性。图6C和图S69显示了ICG治疗小鼠肿瘤部位的PA成像。从图6D可以看出，820 nm通道在注射后1小时显示2.6倍的增加。24小时后，这种增强下降到1.4倍，几乎等于背景信号。 然而，在BDP1-NEt2治疗组中，820 nm处的归一化PA强度在注射后1小时显示显着增强11.3倍，即使在24小时后仍保持在6.5倍。在770 nm通道中也观察到类似的结果。BDP1-NEt2在体内的这种优越稳定性对于持久成像至关重要，并且可以提供可靠的肿瘤诊断信息，例如肿瘤体积和生长速率。
结论
我们报道了一种结合分子内强烈低频振动和强大推挽效应的混合方法，用于设计高性能光声成像造影剂，并借助量子化学计算和实验验证。基于这种方法，我们成功地通过增加非辐射衰变将荧光meso-trifluoromethyl BODIPY支架转化为非荧光支架。加速非辐射衰变的关键设计要素包括（1）空间位阻的增强导致荧光团支架弯曲，从而放大低频振动，以及（2）插入电子供体基团以增强推挽效应并减小光学间隙。有趣的是，BDP1-NEt2不仅继承了传统BODIPYs的光物理特性，包括出色的光稳定性和大消光系数，而且在近红外（NIR）吸收窗口（>800 nm）中显示出强烈的光声信号发射。
参考文献
Blending Low-Frequency Vibrations and Push–Pull Effects Affords Superior Photoacoustic Imaging Agents, Le Yu, Syed Ali Abbas Abedi, Jeongjin Lee, Yunjie Xu, Subin Son, Weijie Chi, Mingle Li,* Xiaogang Liu,* Jae Hyung Park,* Jong Seung Kim*, Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202307797,doi.org/10.1002/anie.202307797.
