内容提要
我们开发了一种基于催化芳胺自由基阳离子形成的设计策略，成功制备出在短波红外区域对移动态 Cu (II) 具有优异敏感性和微米级分辨率成像能力的光声探针。对帕金森病模型小鼠大脑的体内成像显示，在疾病早期阶段，大脑皮层和小脑小叶内的移动态 Cu (II) 水平发生显著变化，这表明在帕金森病早期，这些区域尤其容易受到 Cu (II) 积累的影响。
探针的设计
提高芳胺自由基阳离子（arylamine⁺）稳定性的常用方法包括扩展芳胺的共轭结构，或在邻位或对位引入额外的氨基。例如，苯胺的邻位二聚可使四氢吩嗪（TPAZ）衍生物的氨基自由基阳离子通过两个氮原子和苯环实现电荷离域，从而使 TPAZ 比苯胺自由基阳离子稳定得多。通过给 TPAZ 修饰水溶性基团，可使其自由基阳离子（TPAZ⁺）在水溶液中具有高稳定性。但由于 TPAZ 衍生物的强给电子能力，其极易被空气氧化。因此，设计 Cu (II) 探针的关键在于协同调控芳胺被 Cu (II) 选择性氧化的能力以及生成的芳胺自由基阳离子的稳定性。我们选取了多种芳胺进行系统研究，包括 N,N - 二甲基苯胺（DMA）、2 - 氯 - N,N - 二甲基苯胺（CDMA）、2 - 甲氧基 - N,N - 二甲基苯胺（MDMA）、久洛里定（JLD）、THQ、10 - 乙基 - 10H - 吩噁嗪（POZ）和 5,10 - 二乙基 - 5,10 - 二氢吩嗪（PAZ），以探究它们对 Cu (II) 的响应。在乙腈溶液中，所有这些芳胺在 Cu (II) 存在时都会生成自由基阳离子。紫外 - 可见 - 近红外吸收光谱中 700-1100 nm 处的宽近红外吸收带证实了自由基阳离子的存在。电子顺磁共振（EPR）光谱结果进一步证实了这一点。但将溶剂换为 4 - 吗啉丙磺酸（MOPS）缓冲液（含 40% 乙醇）后，只有 THQ 和 PAZ 保留了与乙腈溶液中类似的吸收带和 EPR 信号；其他芳胺的信号可忽略不计，表明它们无法在水介质中形成稳定的自由基阳离子。尽管 THQ⁺和 PAZ⁺具有近红外吸收，但其实用性受到两个因素的限制：在吸收峰（λabs）处的摩尔吸光系数较低（THQ⁺为 1200 M⁻¹・cm⁻¹，PAZ⁺为 680 M⁻¹・cm⁻¹），且存在 “开启” 响应行为，这使得 THQ 和 PAZ 不适用于比率光声成像。为解决这些局限性，我们尝试将 THQ 和 PAZ 与具有扩展 π 共轭结构的发色团缀合，该策略可能具有增强稳定性和实现比率响应行为这两个优势。首先，发色团的广泛 π 共轭可能会加强 THQ⁺和 PAZ⁺内部的电荷分布，从而形成更稳定的自由基阳离子。其次，由于其大共轭结构，设计的探针有望具有远红光至近红外吸收。在被 Cu (II) 氧化后，生成的自由基阳离子会发生红移，且与未氧化的探针相比，其非辐射跃迁效率提高。这使得通过监测氧化前后近红外光声信号的变化，可实现对 Cu (II) 的比率光声响应。
我们通过 CV 实验评估了这些探针的 FOV。探针 3、7 和 8 的 FOV（0.59-0.69 eV vs Ag/AgCl）高于 CuCl₂，这表明这些探针不能被 Cu (II) 氧化。相反，探针 1、2、4、5、6、9 和 SPACu1 的 FOV 低于 Cu (II)，表明它们极易被 Cu (II) 介导氧化并可能形成自由基阳离子。接下来，我们评估了探针在水溶液中生成稳定自由基阳离子的能力。在 MOPS 缓冲液（含 60% 乙醇）中加入 Cu (II) 后，探针 1-8 的吸收光谱变化极小。相比之下，SPACu1 在 785 nm 处有一个强吸收峰（ε=65000 M⁻¹・cm⁻¹）；当用3当量的 Cu (II) 处理时，该吸收带消失，取而代之的是在 1100 nm 左右出现一个明显的新吸收带。重要的是，EPR 光谱证实了水溶液中 SPACu1⁺的形成，验证了新吸收带的来源。探针 9 的行为与其类似物 SPACu1 不同：在 MOPS 缓冲液中，即使没有 Cu (II)，它也表现出宽的近红外吸收带（700-1200 nm）。加入 3 当量的 Cu (II) 后，842 nm 左右的吸光度略有下降，1200 nm 左右的吸光度则有所上升。EPR 分析为这一行为提供了见解：虽然探针 9 在 MOPS 缓冲液中显示出较弱的 EPR 信号，表明分子与其自由基阳离子（9⁺）共存，但 Cu (II) 处理使信号增加了约 21 倍。这表明 Cu (II) 会进一步将游离探针氧化为 9⁺，导致整体吸收带更宽。所有这些结果都表明，9 在空气氛围下的水溶液中极不稳定，不适合用于体内 Cu (II) 成像应用。基于上述结果，将 THQ 单元与 BODIPY 骨架整合在水溶液中生成稳定的自由基阳离子方面显示出巨大潜力，这使得 SPACu1 有望成为用于 Cu (II) 成像的比率光声探针。
SPACu1 的响应行为
在阐明 SPACu1⁺具有优异稳定性的基础上，我们进一步系统研究了 SPACu1 在 MOPS 缓冲液中对 Cu (II) 的响应行为。首先，我们探究了在空气条件下，SPACu1 与不同当量 Cu (II) 反应后，其紫外 - 可见 - 近红外吸收光谱随时间的变化。结果显示，加入 0.1 当量的 Cu (II) 后，立即出现一个中心位于 1060 nm 的新吸收带，且强度在 15 分钟内几乎保持不变。当 Cu (II) 当量为 0.2 或 0.3 时，1060 nm 处的吸收强度呈线性增长，15 分钟反应后，其强度是 0.1 当量 Cu (II) 存在时的 4-6 倍。然而，当 Cu (II) 当量在 0.5-3.0 范围内时，吸收强度随时间的增长呈非线性变化。15 分钟后，该吸收带强度达到相对稳定状态，1060 nm 处的吸收强度约为 0.1 当量 Cu (II) 存在时的 8-10 倍。为阐明基于催化自由基阳离子形成机制的探针与基于配位机制的探针在性能上的差异，我们将其与我们先前报道的基于配位的光声探针 PACu3 进行了对比研究 。具体而言，我们考察了 PACu3 对不同浓度 Cu (II) 的时间依赖性响应。吸收光谱显示，PACu3 在最初 3 分钟内对 Cu (II) 的响应迅速，随后在 3-15 分钟内趋于稳定。值得注意的是，在低 Cu (II) 浓度（0.1-0.3 当量）下，比率值（Abs880/Abs700）略有增加。然而，在较高 Cu (II) 浓度（0.5-1.0 当量）下，比率值的增加更为显著，最大值达到 0.62。我们进一步比较了 SPACu1 和 PACu3 在响应不同 Cu (II) 浓度时的比率值变化。在低 Cu (II) 浓度下，SPACu1 的比率值始终显著大于 PACu3，且这种差异随时间愈发明显。这些结果凸显了 SPACu1 在检测低水平 Cu (II) 方面比 PACu3 具有更高的灵敏度。我们通过考察氧化后形成的 SPACu1⁺是否能被体内高浓度的还原性物质谷胱甘肽（GSH）还原，进一步探究了 SPACu1 的可逆响应性。在空气和氮气氛围中，加入不同当量的 GSH 后，SPACu1⁺的吸收峰均逐渐降低。加入 1 当量的 GSH 后，吸收峰完全消失，得到的吸收光谱与 SPACu1 初始的吸收峰相似，且与 Cu (II) 氧化过程相反，两者在 880 nm 处均有等吸收点。这证实了 SPACu1⁺能被 GSH 有效还原，表明 SPACu1 对 Cu (II) 具有可逆响应能力。
SPACu1 类似物中 Cu (II) 响应型光声探针的应用范围
受 SPACu1 优异性能的启发，我们基于 SPACu1 设计并合成了一系列具有不同取代基和功能的探针（SPACu2-9）。晶体结构分析为合成分子的结构提供了有力证实。我们首先探究了 BODIPY 核心中位取代基对探针响应行为的影响。实验结果表明，具有不同中位取代基（苯基（SPACu2）、酰胺基（SPACu3）、五氟苯基（SPACu4）或三氟甲基（SPACu5））的探针，其对 Cu (II) 的响应行为与 SPACu1 相似。经3当量 Cu (II) 处理后，探针的主要吸收带完全消失，自由基阳离子的新吸收峰出现在 1000-1200 nm 范围内。这些结果表明，不同取代基仅因其吸电子能力不同而影响这些探针及其相应自由基阳离子的吸收最大值。
体外比率光声成像
我们首先通过 Cu (II) 滴定实验评估了 SPACu5 的体外光声成像能力。探针 SPACu5 及其自由基阳离子的光声光谱与其吸收光谱高度匹配，证实了紫外 - 可见 - 近红外光谱研究的可靠性。接下来，我们利用双通道光声成像模式研究了 SPACu5 在 Cu (II) 存在时的比率光声成像能力。向 SPACu5 的 MOPS 缓冲液中加入 Cu (II) 后，850 nm 通道的光声强度逐渐降低，而 1064 nm 通道的光声强度则随之增加。因此，PA₁₀₆₄/PA₈₅₀的比率值与 Cu (II) 浓度呈正线性相关。经计算，探针 SPACu5 的光声检测限为 17.8 nM，其灵敏度足以检测低于生理水平的 Cu (II)。值得注意的是，生理条件下 Cu (II) 的浓度存在差异，血液血清中为 10-25 μM，脑脊液中为 0.5-2.5 μM，突触间隙中为 30 μM 。重要的是，比率光声成像通过自校准有效消除了 850 nm 和 1064 nm 通道中观察到的背景干扰。这一发现凸显了 SPACu5 在脑部 Cu (II) 比率成像中的潜在应用价值。
总结
我们提出可将催化自由基阳离子形成作为一种新的、可靠的设计策略，用于开发能够在体内动态成像移动态 Cu (II) 的分子探针。所设计的探针能在水溶液中被移动态 Cu (II)（而非结合态 Cu (II)）快速且可逆地氧化，形成稳定的芳胺自由基阳离子。这一优势克服了基于配位的探针通常无法区分移动态与结合态 Cu (II) 的局限性。这些特性使 SPACu 能够在不干扰正常生理条件下铜稳态的情况下，动态追踪体内移动态 Cu (II)。值得注意的是，这一过程伴随着光声信号从约 800 nm 红移至 1060 nm，使该探针非常适合在生物透明窗口内对移动态 Cu (II) 的动态变化进行体内成像。
参考文献
Dynamic Photoacoustic Imaging of Mobile Cu(II) in Vivo via Catalytic Radical Cation Formation,Zhiyong Jiang, Qian Sun, Xiaoqing Wang, Yuncong Chen , Fang Liu, Jing Zhao*, Zijian Guo and Zhipeng Liu *,Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e202500149,https://doi.org/10.1002/anie.202500149
