内容提要
本研究基于磷酞菁（S-PPc）分子开发了一种靶向诊疗剂（S-PPc@ZnDPA），通过磷脂修饰增强其水溶性，并负载靶向分子锌（II）- 双（二吡啶甲基胺）（ZnDPA）。体外和体内实验表明，S-PPc@ZnDPA 在 1064 nm 光照射下能够产生光声信号，且具有高效的光热转换效率（59.4%），是一种具有潜力的近红外二区（NIR-II）吸收纳米制剂，可用于血栓的一体化诊断与治疗。
S-PPc@ZnDPA纳米颗粒的合成
在酞菁（Pc）的 α 位引入具有供电子特性的 4 - 甲氧基苯硫酚基团，合成出具有 820 nm 吸收特性的 S-Pc。通过在 S-Pc 骨架中引入磷元素形成 S-PPc，使 Q 带发生红移，表现出 1020 nm 的特征吸收。为了改善 S-PPc 的水溶性并赋予其靶向能力，我们采用两亲性物质对其进行包裹。首先，通过 S-PPc 与 DSPE-PEG₂₀₀₀和 DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS 之间的疏水相互作用制备出 S-PPc@NHS 纳米颗粒。随后，通过 NHS 酯与 ZnDPA 分子上的伯胺之间的酯化偶联反应，将 ZnDPA 靶向分子连接到 S-PPc@NHS 纳米颗粒上，形成具有独特血小板靶向能力的生物相容性 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒。修饰后的 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒在 1015 nm 处仍保留近红外二区吸收特性。S-PPc@NHS 纳米颗粒的水合直径约为 43 nm，zeta 电位为 - 17.7 mV；而负载 ZnDPA 后，S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒的水合直径略微增大至约 50 nm，zeta 电位升高至 - 5.5 mV。这种水合直径和 zeta 电位的增加显著表明带正电的 ZnDPA 靶向分子已成功负载。S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒的扫描电子显微镜（SEM）图像呈现出均匀的球形形貌。考虑到 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒在 900-1100 nm 范围内的吸收特性，我们在不同功率密度的 1064 nm 激光下对其光热性能进行了评估。当功率密度从 0.2 逐渐增加到 1.0 W/cm² 时，S-PPc@ZnDPA（100 μM）纳米颗粒的温度发生显著变化，升温幅度达到 35 °C。鉴于传统光热疗法在高温下可能对周围组织造成损伤，我们更倾向于使用较低的功率密度来实现更温和的光热治疗。因此，我们研究了在 0.4 W/cm² 激光照射下，不同浓度的 S-PPc@ZnDPA 的温度变化情况。激光照射下纯水仅升温 3 °C，而 10 μM 的 S-PPc@ZnDPA 则升温 8.8 °C4。随着 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒浓度的增加，这种升温效应进一步增强。此外，在浓度为 100 μM 时，最高温度升高 18.6 °C，达到 43.6 °C，这与温和光热疗法的阈值相符。由于光热效应通常伴随着光声信号的产生，我们进一步研究了 S-PPc@ZnDPA 的光声成像性能。首先，光声光谱显示在 920 nm 的激发波长下光声信号达到峰值。该峰值与 S-PPc@ZnDPA 在 1015 nm 处的最大吸收波长不同，这主要是由于测试仪器的限制，其波长扫描范围被限制在 970 nm 以下。随后，我们使用 920 nm 激光对 S-PPc@ZnDPA 进行了光声成像实验。S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒的光声信号强度与其浓度之间存在明显的线性关系。
S-PPc@ZnDPA 在体外的血栓和血小板靶向性及治疗性能
为了评估 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒的血栓靶向性，进一步构建了人工全血凝块模型，同时设置了 PBS 组、S-PPc@ZnDPA 组、S-PPc@PEG 组和 ZnDPA 阻断组。除 S-PPc@ZnDPA 组外，其他各组实验均未观察到明显变化。尤为显著的是，S-PPc@ZnDPA 组的光声信号强度显著增强，约为对照组的 4.5 倍。这种增强归因于血栓中血小板的活化，导致血小板表面的磷脂酰丝氨酸大量外翻。这种外翻为 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒中的 ZnDPA 分子提供了识别和结合的位点，进而形成稳定结构，使纳米颗粒在血栓中富集且不会被 PBS 冲洗掉。相比之下，S-PPc@PEG 组的光声信号与对照组几乎相同，这表明 S-PPc@PEG 无法与血栓形成稳定的结合结构，因此容易被冲洗掉。在 ZnDPA 阻断组中，尽管与 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒共同孵育，但由于 ZnDPA 分子预先占据了血栓上磷脂酰丝氨酸外翻的识别位点，导致 S-PPc@ZnDPA 无法有效靶向结合，最终也被冲洗掉。
为了验证 S-PPc@ZnDPA 的体外光热溶栓性能，在存在试剂的情况下，用 1064 nm 激光照射血栓。在激光照射前，混合物保持其原始颜色。然而，照射后，混合物变得浑浊，表明血红蛋白和纤维蛋白从血栓中释放出来。第二组和第三组的血栓表面出现部分变色和粗糙化。混合物在 450 nm（纤维蛋白）和 540 nm（血红蛋白）处的吸光度可以定量反映血栓溶解的程度。在没有激光照射的情况下，三组的纤维蛋白和血红蛋白水平相似，表明在此条件下血栓溶解极少。然而，在激光照射后，第一组（PBS 组）的纤维蛋白和血红蛋白水平适度增加，表明仅光热效应就有助于血栓降解。值得注意的是，由于具有 ZnDPA 靶向基团，S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒比缺乏靶向能力的 S-PPc@PEG 表现出显著更高的溶栓效果。
S-PPc@ZnDPA 在体内对血栓的治疗效果
基于在体外对血栓中血小板的高效靶向性，开展了体内实验以评估 S-PPc@ZnDPA 的血栓靶向治疗效果。首先，建立了小鼠下肢动脉血栓模型，在立体显微镜操作下，分离小鼠下肢动脉，随后用氯化铁孵育诱导 5 分钟，血管表面发生显著变化，具体表现为血管颜色明显变暗。为进一步验证模型构建效果，采用光热成像检查小鼠下肢模型腿部的温度变化。对比结果显示，假手术腿的温度维持在 22.9°C，而模型腿的温度降至 20.8°C。这种显著的温度降低正是由于血栓形成后血流受阻所致。因此，这些结果表明小鼠肢体动脉血栓模型构建成功。为确定 S-PPc@ZnDPA 在血栓部位的聚集时间，采用了体内光声成像技术。研究中设置了三组实验：S-PPc@ZnDPA 组、S-PPc@PEG 组和 ZnDPA 阻断组。S-PPc@ZnDPA 和 S-PPc@PEG 纳米颗粒通过尾静脉注射直接进入体内，而 ZnDPA 阻断组先注射 ZnDPA，15 分钟后再注射 S-PPc@ZnDPA。对每组在 0、20、40 和 60 分钟四个时间点进行光声成像，角放大的黄色区域为血栓血管，左侧绿色区域为相应的正常血管，并使用 LOIS View 3D 软件对其进行定量分析。S-PPc@ZnDPA 组在 40 分钟时血栓区域相对于正常腿部血管的信号值最高，而在 60 分钟时回落至正常水平。相比之下，S-PPc@PEG 组的光声信号比值始终低于 （血栓血管中的光声信号与相应正常血管的光声信号相等），这表明 S-PPc@PEG 纳米颗粒在体内更像是游离在正常血管中，对血栓没有表现出靶向能力，且在狭窄的血栓血管中的浓度低于正常血管。对于 ZnDPA 阻断组，结果与 S-PPc@PEG 组相似，因为预先注射的 ZnDPA 水溶液占据了血栓中的结合位点，从而有效阻止了后续 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒在血栓部位的聚集，导致其光声信号比值也低于 。这些结果证明了 S-PPc@ZnDPA 在体内具有明确的血栓靶向能力。
在确认聚集时间后，进行了血栓的温和光热治疗实验。首先构建血栓模型，然后通过尾静脉注射向不同组的小鼠体内注入试剂。40 分钟后，使用低功率密度的 1064 nm 激光照射小鼠的血栓区域，同时使用红外热像仪实时监测并记录血栓部位的温度变化，以评估纳米颗粒的体内光热性能。在 S-PPc@ZnDPA 组中，仅经过 5 分钟的激光照射，血栓部位的温度就从 25°C 显著升高至 42°C，并迅速进入稳定状态。该温度较为温和适宜，不会对周围皮肤组织造成损伤。相比之下，注射 PBS 的小鼠在相同时间内血栓部位的温度仅从 25°C 升高至 37°C。在 S-PPc@PEG 组中，尽管温度在 5 分钟内也升高至 40°C，但升温效果不如 S-PPc@ZnDPA 组，这归因于 S-PPc@ZnDPA 纳米颗粒在血栓上的高效聚集。
总结
本研究成功设计并合成了具有近红外吸收特性的磷脂酰酞菁配合物S-PPc，通过磷脂包封显著提高了水溶性，并成功负载靶向分子ZnDPA，得到了S-PPc@ ZnDPA纳米粒，该创新纳米粒不仅保留了近红外吸收特性，而且具有良好的胶束稳定性、生物相容性，在体外和体内实验中，S-PPc@ZnDPA可以有效地靶向血栓中的血小板，并在低功率密度的NIR-II激光辐射下产生光声信号和温和的光热效应，这一结果不仅为温和的光热消融血栓提供了重要的实验依据，而且预示着临床应用前景广阔。
参考文献
Phosphorus Phthalocyanine-Based NIR-II Nanoparticles for Photoacoustic Imaging and Photothermal Therapy of Thrombus,Zhaoyang Liu, Yufeng Zhu, Yilan Jin, Rong Wang, Junjie Xia, Yingqiao Wang, Hong Yang, Changxin Shen,* Shiping Yang, and Zhiguo Zhou*,ACS Appl. Bio Mater. 2025, 8, 5172−5182,https://doi.org/10.1021/acsabm.5c00522
