内容提要
本研究通过调控分子结构和分子内运动，增强其荧光、光声（PA）和拉曼特性，用于三模态成像引导的癌症手术。化合物 OTPA-TQ3 能产生最强的荧光、光声和拉曼（2215 cm⁻¹）信号，是首个集成这些光学成像模态的有机分子。基于 OTPA-TQ3 的纳米试剂的体内实验有助于在不同手术阶段解读肿瘤信息，并改善癌症手术效果。术前荧光和光声成像能够提供全面的肿瘤信息，而术中荧光和拉曼成像则能以高灵敏度、高对比度的方式勾勒出肿瘤边缘。
合成、表征及光物理性质
本研究采用烷氧基取代三苯胺（OTPA）作为供体，噻二唑并喹喔啉（TQ）作为受体，构建近红外发色团。强 D-A 相互作用确保了高效的分子内电荷转移（ICT），这有利于实现小的电子带隙，从而产生近红外吸收和发射。三苯胺单元中的辛氧基取代基不仅能增强给电子能力，还能使所得化合物具有良好的溶解性和可加工性。我们合成了一系列在 TQ 核心具有不同取代基（即苯基、苯基 - 炔基和苯基 - 炔基 - 苯基）的类似物，以研究它们对荧光、光声和拉曼等光学成像性质的影响。化合物 OTPA-TQ1-3 在四氢呋喃（THF）中的吸收光谱在 600-750 nm 范围内有强吸收，与市售荧光和光声成像系统的激发光源匹配良好。最大吸收系数按 OTPA-TQ2 < OTPA-TQ1 < OTPA-TQ3 的顺序递增，这与计算的振子强度趋势一致。OTPA-TQ3 较高的吸收系数有利于高效的光激发。化合物 OTPA-TQ1-3 在 THF 溶液中的光致发光（PL）最大值分别依次位于 894、911 和 910 nm。约 200 nm 的大斯托克斯位移有效避免了激发光谱和发射光谱的重叠，有利于荧光的高效利用。然后，我们通过向 THF（良溶剂）溶液中加入水（不良溶剂）来研究它们的荧光性质。对于这三种化合物，当水的体积分数从 0% 逐渐增加到 30% 时，PL 强度略有下降，这是由于溶剂极性效应以及由此向扭曲分子内电荷转移（TICT）态的转变所致 当水的体积分数进一步增加到 95% 时，发射强度显著增强，表现出典型的 AIE 特征。有趣的是，在水体积分数为 95% 的 THF - 水混合体系中，OTPA-TQ3 的 αₐᵢₑ值（定义为聚集态与溶液态的最大 PL 强度之比）高于其他两种衍生物，这是因为 OTPA-TQ3 上较大的扭曲旋转单元（苯基 - 炔基 - 苯基）减少了聚集态中的分子间相互作用，如 π-π 堆积。
纳米颗粒的制备、表征及荧光性质
通过纳米沉淀法，使用两亲性脂质 - PEG2000 共聚物作为包封基质，将 OTPA-TQs 制备成稳定的小尺寸纳米颗粒（NPs）。疏水性有机分子在核心随机组装，两亲性表面活性剂形成外壳，从而得到水溶性纳米颗粒。通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）分别表征了 OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的尺寸和形貌。DLS 数据显示 OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的水动力学直径分别为 141、142 和 144 nm，TEM 图像表明这三种纳米颗粒均呈近似球形，平均直径相似，为 110-120 nm。TEM 测量得到的尺寸较小，可能是由于干燥的 TEM 样品中水化层收缩所致 ³⁷。所得纳米颗粒为绿色溶液，透明度良好，与四氢呋喃中的分子类似。OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的最大吸收峰分别位于 684、701 和 705 nm，与溶液状态相比略有红移。相反，OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的光致发光光谱峰分别位于 880、897 和 895 nm。与四氢呋喃溶液相比，纳米颗粒发射光谱蓝移约 15 nm，这可能是由于纳米颗粒中的荧光分子被极性低于四氢呋喃的同种分子包围所致。
化合物和纳米颗粒的光声特性
我们研究了OTPA-TQ 分子的结构与光声特性之间的关系，以及旋转单元大小对光声信号输出的影响。首先，我们使用甘油来提高溶液粘度，以研究其对化合物分子内运动的影响，这一点已通过粘性环境中光致发光量子产率的提高得到证实。值得注意的是，OTPA-TQ3 的亮度增强最为显著，这可能归因于其显著的聚集诱导发光特性。在 N,N - 二甲基甲酰胺（DMF）- 甘油混合体系中，随着甘油比例的增加，三种分子的光声强度均有所下降，这表明分子内运动对光声信号输出起着关键作用。当甘油比例从纯 DMF 增加到 90% 时，OTPA-TQ3 的光声振幅显著下降了 65%，这一比其他两种衍生物（OTPA-TQ1 为 40%，OTPA-TQ2 为 50%）更为明显。这一结果表明，较大分子旋转单元的激发态分子内运动对光声产生的贡献更大。通过在 680-950 nm 的不同波长下测量光声强度，记录了 OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的光声光谱。OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的光声光谱与其吸收曲线吻合良好，表明光声信号源于分子的近红外吸收。在 680 nm 近红外脉冲激光照射下，对于每种 OTPA-TQ 分子（50 μM），其纳米颗粒状态（通过动态光散射测得直径为 140 nm）的光声强度约为其在水体积分数为 95% 的四氢呋喃 - 水混合体系中的裸聚集态（无脂质 - PEG2000）的 2.5 倍（通过动态光散射测得聚集态的粒径分布较宽，>400 nm）。由于两亲性共聚物脂质 - PEG2000 作为表面活性剂，能从根本上提高疏水性分子的水溶性，并提供更大的比表面积，从而在水介质中实现更有效的激发态分子内运动，这一结果进一步验证了激发态分子内运动与光声信号输出之间存在正相关关系。比较三种 OTPA-TQ 纳米颗粒的光声振幅，OTPA-TQ3 纳米颗粒的光声强度最高，约为其他两种对应纳米颗粒的 1.4 倍。这可能是由于较大的苯基 - 炔基 - 苯基旋转单元导致更强的分子内运动，从而产生更强的光声信号。OTPA-TQ3 较高的吸收系数也可能是其荧光和光声性能优异的原因之一。我们还将 OTPA-TQ 纳米颗粒的光声振幅与已知的高性能光声成像剂（包括半导体聚合物纳米颗粒（SPNs）和亚甲蓝（MB））进行了比较。由于 MB、SPNs 和 OTPA-TQ1-3 纳米颗粒在约 680 nm 处具有相似的吸收，因此可以在相同浓度（50 μM）下使用 680 nm 脉冲激光进行合理比较。在相同实验条件下，OTPA-TQ3 纳米颗粒的光声振幅分别是 SPNs 和 MB 的 1.7 倍和 2.4 倍。此外，OTPA-TQ3 纳米颗粒的光声强度与其摩尔浓度呈良好的线性关系，表明其具有定量分析的潜力。
化合物和纳米颗粒的拉曼特性
在 OTPA-TQ2 和 OTPA-TQ3 分子中引入炔基，是因为已知炔基能在细胞沉默区产生拉曼特征峰。图中展示了 OTPA-TQ1-3 纳米颗粒的拉曼光谱。值得注意的是，与其他两种纳米颗粒不同，OTPA-TQ3 纳米颗粒在 2215 cm⁻¹ 处具有相当强的拉曼信号，该位置处于细胞沉默区，对应于炔基典型的碳 - 碳三键伸缩振动特征峰。OTPA-TQ3 的强拉曼信号可能归因于苯基 - 炔基 - 苯基单元的大共轭体系，使其成为一种高效的生物标志物，可用于高特异性拉曼成像且背景干扰可忽略不计。通过研究 OTPA-TQ3 在游离分子状态（四氢呋喃溶液中）、大聚集态（水体积分数为 90% 的四氢呋喃 - 水混合体系中）和纳米颗粒状态下的拉曼光谱，探究了分子内运动对拉曼特性的影响，OTPA-TQ3 纳米颗粒在 2215 cm⁻¹ 处的拉曼强度比大聚集态强得多，而游离分子的拉曼信号最强，这与先前报道的分子运动可产生拉曼散射的结论一致。由于聚合物表面活性剂脂质 - PEG2000 有利于 OTPA-TQ3 在水中的溶解性，从而促进分子内运动，这一结果表明，苯基 - 炔基 - 苯基在不受限制的自由运动状态下的拉曼强度会比受限聚集状态下的更强。根据拉曼散射的基本理论，分子吸收光后会被激发到虚能态。在我们的研究中，入射光（532 nm）的波长也可能导致 OTPA-TQ3 分子发生电子跃迁。因此上述高能态下的分子内运动会显著增强苯基 - 炔基 - 苯基的拉曼信号。
术前肿瘤的荧光和光声成像
我们使用 OTPA-TQ3 纳米颗粒进行后续体内实验，以研究这种具有优异荧光 - 光声 - 拉曼特性的光学试剂是否有助于精准的影像引导癌症手术。由于术前成像需要良好的空间分辨率和高灵敏度，以揭示体内肿瘤的大小、数量和位置，我们对 4T1 皮下肿瘤小鼠静脉注射 OTPA-TQ3 纳米颗粒后，同时进行了近红外荧光成像和光声成像。注射纳米颗粒后，在指定时间间隔内，使用 IVIS 成像系统和小动物光声断层扫描系统（MOST）对荷瘤小鼠进行同步扫描。图中显示了随时间变化的体内无创近红外荧光图像，图中描绘了肿瘤部位相应的荧光强度 - 时间关系，结果表明，由于被动的增强渗透和滞留（EPR）效应，肿瘤部位的近红外荧光信号随时间逐渐增强。OTPA-TQ3 纳米颗粒优异的 EPR 效应应归功于其合适的尺寸和表面化学性质。除肿瘤外，纳米颗粒容易聚集的网状内皮系统（RES）器官（包括肝脏和脾脏）也被照亮。注射后 24 小时，肿瘤部位的荧光信号达到最大值，肿瘤与背景（周围正常皮肤自发荧光）的比值高达 9.2，根据文献报道，这一比值被认为是非常高的。另一方面，在 24 小时的研究期间，我们还使用光声仪器对小鼠进行成像。肿瘤中的光声信号随时间逐渐增强，并在注射后 24 小时达到峰值，这与时间依赖性荧光成像结果的趋势高度一致。值得注意的是，24 小时时肿瘤中的平均光声信号是注射前（0 小时）背景信号的 7.0 倍，性能优于许多高性能光声成像试剂。
术中微小残留肿瘤的荧光和拉曼成像
在本研究中，将 OTPA-TQ3 纳米颗粒静脉注射到 4T1 荷瘤小鼠体内 24 小时后，外科医生凭借经验进行了第一次手术（S1），随后同时进行近红外荧光和拉曼成像。如果苏木精 - 伊红（H&E）组织学分析证实肿瘤已被完全切除，则手术切口部位不会出现荧光和拉曼信号。在其他存在微小肿瘤残留的情况下，可以观察到一定程度的荧光信号。尽管 OTPA-TQ3 纳米颗粒具有相当强的近红外荧光，但残留肿瘤的体积很小，导致其中的纳米颗粒数量很少。此外，正常组织的自发荧光也会降低信噪比。因此，外科医生无法准确判断弱荧光区域是否确实为肿瘤。即便如此，术中荧光成像仍然非常必要，因为它快速、灵敏、实时，能够迅速指出可疑的残留肿瘤区域。为了实现精准的手术治疗，我们在荧光微弱的可疑区域进行了具有显微分辨率的拉曼成像。在细胞沉默区具有强拉曼信号（2215 cm⁻¹）的 OTPA-TQ3 纳米颗粒，能够通过拉曼成像以 “有或无” 的特征灵敏地显示残留肿瘤及其与正常组织的边界。术中残留肿瘤检测的这种优异效果应归功于 OTPA-TQ3 纳米颗粒的高拉曼信号以及拉曼成像在细胞沉默区固有的零背景特性。值得注意的是，结合 H&E 组织学分析，94% 的具有拉曼信号的受试微小区域被证实为肿瘤。由于拉曼成像比组织学分析快得多，它在术中残留肿瘤检查中具有巨大潜力。值得一提的是，使用 OTPA-TQ3 纳米颗粒的术中荧光 - 拉曼成像能够清晰勾勒出 S1 后直径约 450 μm 的微小残留肿瘤。在证实存在残留肿瘤后，外科医生可以进行第二次手术（S2）以切除残留肿瘤，直至没有荧光和拉曼信号。
总结
我们开发了一种用于综合影像引导手术应用的 “一体化” 分子试剂。单一有机分子中的荧光、光声和拉曼特性受分子结构和分子内运动的显著影响，因为它们会作用于光物理性质及相应的光学成像性能。与其他两种化合物相比，具有最大分子内旋转单元的 OTPA-TQ3 具有最扭曲的三维分子结构和最强的聚集诱导发光效应，这有利于在水介质中获得最高的近红外荧光亮度。此外，强烈的激发态分子内运动和高吸收系数赋予 OTPA-TQ3 最强的光声信号产生能力。而且，苯基 - 炔基 - 苯基单元确保 OTPA-TQ3 纳米颗粒在细胞沉默区 2215 cm⁻¹ 处具有强拉曼信号，且光激发后高能态下的分子内运动被证实能显著增强拉曼信号。借助荧光成像的高灵敏度以及光声技术良好的空间分辨率和穿透深度，静脉注射的 OTPA-TQ3 纳米颗粒能够在术前检测肿瘤并指导手术方案。癌症手术期间的进一步术中成像表明，OTPA-TQ3 纳米颗粒凭借快速、实时、灵敏的荧光成像以及零背景的高对比度拉曼成像，可帮助外科医生精准切除所有微小残留肿瘤，从而显著延长术后小鼠的生存期。
参考文献
Boosting Fluorescence-Photoacoustic-Raman Properties in One Fluorophore for Precise Cancer Surgery,Ji Qi,Jun Li, Ruihua Liu, Qiang Li,Haoke Zhang,Jacky W.Y. Lam,Ryan T.K. Kwok,Dingbin Liu,Dan Ding ,* and Ben Zhong Tang *,Chem 5, 2657–2677, October 10, 2019,https://doi.org/10.1016/j.chempr.2019.07.015
