内容提要
长波长、近红外小分子染料在生物光子学中具有重要的应用价值。传统上，它们依赖于扩展的芳香结构来实现红移，这是以牺牲应用性能为代价的如光稳定性、细胞渗透性和功能性。本文报道了一种基态反芳香性策略，展示了14种阳离子氨基芴染料的简洁合成，这些染料具有微小的结构，光谱范围为700-1600 nm。氨基芴染料具有细胞渗透性，可通过简单的羧基化实现快速肾脏清除。我们开发了一个紧凑的分子传感平台，用于体内细胞内传感，并展示了这些染料在多光谱荧光和光声成像中的广泛应用。在电子激发下的芳香性反转，不仅减少了能量带隙，而且引起了强的振动耦合，从而产生了超快的激发态动力学和无与伦比的光稳定性。
实验结果与讨论
分子设计与合成
我们设计了一个紧凑的发色团单元，其中两个胺基团连接到阳离子芴骨架的C3和C6位置，其中包含一个4π电子五元环作为反芳核。这种氨基芴(AF)发色团在结构上类似于具有六元芳核的吡啶蛋白染料，但在前沿分子轨道构型上有显著不同。在苯环之间的HOMO中形成了一个反键节点，在LUMO中形成了一个成键节点)。这导致HOMO的不稳定和LUMO的稳定，从而导致HOMO-LUMO间隙明显缩小。Barker等人在1954年的一项开创性工作证实了这一假设，他们报告了一种近红外吸收超过900 nm的9-苯基取代的氨基芴结构。由于基态缺乏电子，染料在质子溶剂中迅速褪色，在本文的制备过程中，Grzybowski等人尝试了一种立体芳基策略来稳定水中的阳离子芴骨架。我们以简洁的两步路线合成了具有立体保护和取代多样性的AF染料，从氮亲核试剂与相同底物二溴芴酮的Buchwald-Hartwig C-N交叉偶联开始，然后添加芳基锂以安装立体阻碍芳基基团。
结构与性能的关系
在二氯甲烷(DCM)中研究了AF染料的光物理性质。我们在光谱轴上绘制了吸收最大值和相应的取代基图，以便直观地进行比较。AF染料的光谱覆盖范围为700 ~ 1600 nm，吸收最大值(λabs)为800 ~ 1101 nm，发射最大值(λem)为933 ~ 1187 nm。在AF1和AF2中，吸收光谱的“0-1”边带明显较大，在吸收红移时减小，这表明在电子激发下存在不同程度的振动耦合。S0-S1激发的理论计算与这一结果相吻合。揭示了homo和LUMOs在胺基序上的电子离域促进了吸收红移和增强我们进一步绘制了吸收带的λabs和峰肩比(0-0和0-1吸收的比值)与胺基序的垂直电离能(VIEs)的关系。除了脂肪基(AF1, AF2)的伯胺和副胺，以及三种芳香胺(AF12, AF13, AF14)外，还观察到极好的线性相关性。这种线性偏差可归因于AF骨架的振动耦合引起的光谱增宽，这种效应随着胺基的电子离域增加而减弱。此外，挂载芳基上的取代基精细调节吸收最大值(AF3:甲基-，(λabs = 959 nm;AF4:甲氧基-，(λabs = 983 nm)，提示芳基与芴酮骨架之间存在弱电子耦合。结构-吸收关系与从杂蒽型染料中观察到的相似，这意味着取代基调节反芳香族和芳香族染料吸收的规律相似。
细胞通透性和光稳定性的研究
我们进一步探索了其在生物应用中的小尺寸优势。有必要研究它们对生物环境的化学稳定性，特别是在活细胞中最丰富的亲核硫醇谷胱甘肽(GSH)存在的情况下。我们绘制了所有AF染料作为GSH浓度函数的剂量响应曲线。在细胞内GSH (1-10 mM)条件下，所有染料均存活，但当GSH浓度超过100µM时，AF4、AF7和AF13的吸光度下降。我们将这种现象归因于二氟氮杂啶和二苯胺的给电子能力降低，以及2,6 -二甲基芳基与2,6 -二甲基芳基相比，2,6 -二甲氧基的空间位阻降低。在通过CCK-8实验确定了AF2和AF3在10 μM染料浓度下的低细胞毒性后)，我们意外地发现，AF染料在NIR-II光谱(1100 nm长通滤光片)共孵育30秒内就能使细胞染色明亮。尽管不成熟的NIR-II共定位技术存在局限性，但根据它们在细胞核周围的点状分布，我们推测这些信号主要发生在线粒体中。在任何情况下，这一特性使得通过近红外荧光成像研究细胞-染料相互作用特性变得切实可行。为了说明细胞染色与分子大小之间的相关性，在与AF3相同的激发和荧光获取条件下，使用市售的NIR-II染料IR104850进行细胞成像比较，其分子量为653 Da。AF3在10分钟内以大约80的高信号背景比(SBR)有效地染色细胞，而IR1048即使在共孵卵30分钟后也未能进入细胞，导致没有可观察到的信号。细胞外液的定量分析显示，>90%的AF3渗透到细胞中，比IR1048高42倍。结果说明了小结构在细胞通透性和染色强度方面的优势。光漂白是重访染色样品的主要障碍。因此，我们进行了体外光暴露试验来检测AF染料的光稳定性。在水溶液中，AF染料(AF2、AF3、AF11、AF14)在激光照射30 min(功率密度为1.6 W cm-2, AF2、AF3、AF11为808 nm, AF14为980 nm)后吸光度和化学结构没有变化，而常用的近红外染料Cy7在相同功率密度的808 nm激光照射后3 min内吸光度迅速衰减。然而，在相同的光照条件下，我们没有观察到IR1048在有机溶剂中的光漂白(IR1048不溶于水)，这可能是由于NIR-II染料的低带隙使光氧化物质的产生最小化。为了进行彻底的比较，AF3和IR1048进行了显微镜分析，其中染料沉积在载玻片上，暴露在空气中，并接受强激光照射(AF3为808 nm, IR1048为980 nm，功率密度为200 kW cm-2)，同时记录荧光变化。观察到，辐照2 h后，AF3保留了近90%的荧光信号，而IR1048的荧光信号衰减超过50%。AF3卓越的光稳定性在连续细胞成像中得到进一步证明，允许在808 nm强激光照射(200 kW cm-2))下进行超过1000次重复的快照记录。值得注意的是，图像保持了相对较高和稳定的SBR。与之形成鲜明对比的是，当cy7染色的细胞在相同功率密度下以808 nm重复激发时，它们在不到15帧的时间内完成了完全漂白。总的来说，这些结果突出了AF染料的超热稳定性，它在具有挑战性的条件下具有重要的光学成像前景。
AF染料在体内荧光生物成像的药代动力学和生物分布
AF染料的小结构为化学修饰提供了很大的灵活性。这对于开发具有精细调节药代动力学和生物分布的造影剂非常方便，这可能会在器官/组织特异性治疗和临床翻译中找到广泛的应用。我们对AF2和AF3分别增加一个羧基，但在pH为7.4时，油水分配系数(cLog D)大幅下降(-4.19)。计算发现，在pH 7.4条件下，超过99%的AF2-COOH和AF3-COOH以两性离子形式存在，这意味着与生物物种的非特异性相互作用减少。为了进行直接比较，我们合成了一种分子量约为43300 Da的AF3-葡聚糖缀合物，它代表了一种传统的水溶性大结构染料修饰方法。我们对AF3、AF3- cooh和AF3-葡聚糖进行体内荧光成像，以跟踪它们随时间的生物分布。在静脉注射后20分钟，AF3迅速勾勒出肝脏和肠道，这可能是由于其有效的细胞渗透性。AF3-COOH在肝脏短暂出现1分钟，迅速代谢至小肠，膀胱内信号蓄积，提示存在肝肠循环和肾清除的复合代谢途径。af3 -葡聚糖的荧光模式与AF3-COOH相似，但在血管中表现出可观察的信号，在肝脏中表现出持续时间较长的信号，这是合理的，因为葡聚糖分子量分布较广。在接下来的80 ~ 100分钟内，这三种化合物的肝脏信号被代谢，膀胱中AF3COOH和af3 -葡聚糖的信号达到一个明亮的平台，直到排尿。这些结果强调了分子结构和分子量变化对AF染料的药代动力学和生物分布的重要影响。受其快速肾脏清除特性的启发，我们被驱使去研究AF3-COOH在临床前诊断中的潜在应用。考虑到AF3-COOH可以潜在地快速诊断RIR，我们在右肾(RK)和健康左肾(LK)的小鼠模型中静脉注射AF3-COOH。同样的方法应用于af3 -葡聚糖，作为大分子对照。我们观察到，AF3-COOH的荧光信号在11分钟内迅速从健康肾脏中清除，而af3 -葡聚糖则需要60分钟。相反，两种药物在RIR肾内逐渐积聚，导致注射后60分钟荧光信号增强。因此，AF3-COOH在11分钟内实现了100%超过Rose标准(SBR > 5)的SBR(定义为RK/LK比率)，其速度比AF3-Dextran快6倍(图5小时)。这些结果证明了AF染料在临床诊断中的巨大价值，具有提前诊断时间和提高生物相容性的潜力。AF染料在光谱和药代动力学调整方面的灵活性使我们能够展示AF染料在多路成像中的效用。为了技术演示，建立了一个自制的宽视场NIR-II多光谱成像实现(图左)，其中使用三种波长的激光(这里我们使用730、808和940 nm)逐步激发样品，并在一个NIR-II通道(>1100 nm)收集荧光。在动物成像实验之前，我们记录了AF2和AF3的激发光谱(图中)，并使用非负矩阵分解(NMF)算法对图像堆栈进行解混。在我们确定了每个通道(AF2/AF3)的最小信号串音(小于5%)后，我们采用静脉注射方式分别给两组小鼠注射AF2和AF3- cooh的混合物或AF2- cooh和AF3-葡聚糖的混合物，并在注射后30分钟进一步进行多光谱成像。与单一光谱通道的混合信息不同，NMF光谱分解清晰地呈现了同一只小鼠的多种代谢途径，这是由于造影剂的药代动力学多样性(图右)。总之，这些实验验证了AF染料在结构修饰方面的优势，展示了在体内成像的潜力。
基于AF骨架的微型传感平台
我们设想了一个基于AF染料的微型传感平台，这将是基于反芳香系统的近红外光学探针的先驱。我们发现AF2在温和的碱性环境中很容易去质子化，导致吸收峰从875 nm到590 nm的蓝移。因此，AF2的乙酰化可以顺利地提供模型化合物AF2Ac，它模拟了基于酰胺断裂的可激活探针，这是一种用于感应活性氧(ROSs)和蛋白酶的一般机制。与AF2和去质子化形式(AF2在pH为13时)相比，AF2Ac在500-1000 nm处的吸光度在pH为7时消失，表明失去了大的离域π结构。AF2Ac和AF2的光谱在1-9的pH范围内相当稳定，这意味着AF2有望用于可靠的生物传感。作为概念验证，我们合成了具有硼酸基序的AF2B，该基序对过氧亚硝酸盐(ONOO)敏感，这是炎症组织中过量产生的生物标志物。在加入不同浓度(0-0.5当量)的ONOO后，PBS 7.4中AF2B的吸光度在700-1000 nm左右逐渐评估，并在数秒内达到平台。当ONOO-浓度达到0.5当量(eq.)时，808 nm激发下对应的辐射增加了20倍，并且对其他活性物质，包括ClO- (50 eq.)、H2O2 (50 eq.)、•OH (20 eq.)和•O2 - (50 eq.)表现出很高的选择性。所有这些结果都表明对生物学相关的ONOO-有合格的反应。AF2B的光谱变化进一步鼓励我们证明其在其他光学成像模式中的广泛应用，例如，作为多光谱光声层析成像(MSOT)的声源平台。首先，我们用水溶性PA基准吲哚菁测试了几种AF染料的光声(PA)读数(由于仪器激发的限制，测试了AF1、AF2和AF3)。在平行比较中，AF染料表现出与分子吸收相关的稳定的PA光谱形状，并且在较宽的染料浓度范围内(50-200µM)表现出线性增加的PA信号，而ICG则表现出扭曲的PA光谱形状和非线性信号。结果表明，AF染料在水中良好的溶解度使其具有稳定的光谱行为，适用于体内MSOT。实验结束后，AF2B与ONOO-发生反应，在680-970 nm激发谱上产生OFF-ONtype PA信号，显示了深层组织ONOO光声检测的潜力。我们检测了AF2B在细胞和动物成像中的表现。AF2B在脑毛细血管内皮细胞(BCECs)中孵育后，我们可以在荧光显微镜下观察到一个非常弱的染色模式，这表明我们的探针不能被细胞中正常的onool水平激活。onoo处理0.5 h后，荧光亮度提高9倍。为了证实这些结果，我们在一组ONOO预处理的bccs中加入了一种ONOO-清除剂尿酸，并用AF2B染色细胞。与onoo处理组相比，信号强度降低了3倍，证实了AF2B在细胞中的激活。接下来，我们在小鼠右半球建立了可重复的创伤性脑损伤(TBI)模型，因为ONOO-在TBI后数小时内过量产生。在损伤后12小时静脉注射AF2B，然后在给药后半小时进行MSOT。在同一只小鼠的左半球(正常)和右半球(TBI)中观察到总PA信号的显著差异。通过光谱分解方法，AF2的信号可以从其他主要吸光物质中分离出来，例如脱氧血红蛋白(HbR)和氧合血红蛋白(HbO2)。我们观察到脑外伤区HbR信号增加了8倍，HbO2信号减少了2.4倍，AF2信号增加了6倍，这表明脑外伤中依次发生了血脑屏障损伤、凝血、缺氧和ONOO过量产生等事件。总之，这些结果证明了一个基于微型AF染料的强大的声源平台。
总结
本文合成了一系列基于二氨基芴骨架的立体保护抗芳染料，分子量为299 ~ 504Da，光谱范围为700 ~ 1600 nm。我们开发了一个基于反芳香骨架的微型分子传感平台，并证明了微型AF骨架功能化的可行性，以获得药物动力学和生物分布可调性，使其成为体内近红外生物成像和传感的有力工具。本研究促进了抗芳香染料的生物应用，并强调了抗芳香性是染料开发的一个有用的设计规则，以克服芳香系统的局限性。
参考文献
Ultra-photostable small-molecule dyes facilitate near-infrared biophotonics,Kui Yan, Zhubin Hu, Peng Yu, Zuyang He , Ying Chen , Jiajian Chen , Haitao Sun , * Shangfeng Wang * & Fan Zhang ,* Nat. Commun. (2024) 15:2593 ,https://doi.org/10.1038/s41467-024-46853-0
