内容提要
单分子定位显微镜(SMLM)是实现超分辨衍射极限成像的有力技术。虽然目前具有多种类型的闪烁荧光团用于SMLM，但在单分子水平上闪烁荧光团很少见。我们报道了基于纳米石墨烯的高通用性SMLM的固有突发闪烁荧光团的合成，在空气和各种pH溶液中成像淀粉样蛋白原纤维，没有任何添加剂和生理条件下活的哺乳动物细胞的溶酶体动力学。通过点击化学，叠氮功能化纳米石墨烯实现了初级感觉神经元新生蛋白的单分子标记。SMLM成像显示在轴突分支处有更高的局部平移，而平移焦点的大小在整个网络中保持相似。这些结果表明纳米石墨烯基荧光团在超分辨率荧光成像中的潜力。
实验结果与讨论
DBOVOTEG的合成及其光物理性质
为了合成具有亲水性和生物相容性的纳米石墨烯，在DBOV核心(DBOV- oteg)上引入了6条亲水性四乙二醇(TEG)链。通过荧光相关光谱(FCS)测量证实，DBOV-OTEG可以在二甲亚砜(DMSO)中分子溶解，而PBS中显示存在大小为~ 10 nm的小聚集。在水溶液中测量了DBOV-OTEG的紫外-可见(UV - vis)吸收和发射光谱，其最大值分别为658和667 nm, Stokes位移为205 cm-1，全宽度为40和38 nm。对于SMLM成像，两个关键的闪烁属性，光子数(每次闪烁事件检测到的平均光子数)和开-关占空比(分子驻留在其荧光状态的时间的一部分)，是确保高质量图像的关键。利用单分子荧光分析，在激光密度为5 kW/cm2的642 nm激光器下，每个闪烁事件的高光子数为~ 3000，低开-关占空比为10-3)，闪烁时间约为71 ms，可与优化的特殊闪烁缓冲条件下的金标准Alexa647相媲美。在较宽的pH范围内(pH 1~13)测量了DBOV-OTEG的闪烁特性，没有观察到明显的变化，表明DBOV-OTEG对pH不敏感，可以在各种pH环境下使用。因此，与大多数可光切换/闪烁荧光团不同，DBOV-OTEG可以在广泛的环境中使用，包括溶酶体内部的酸性微环境(pH 4.5−5)，并且可以承受用于膨胀显微镜的水凝胶的样品制备条件(pH 7)和纳米载体的表面功能化。
纳米石墨烯用于不同环境下生物材料的SMLM成像
为了证明DBOV-OTEG在不同环境下的稳健性，我们在空气和不同pH值的水溶液中对淀粉样蛋白原纤维(Aβ1−42)进行了SMLM成像。DBOV-OTEG通过物理吸附与淀粉样蛋白原纤维结合。DBOV-OTEG标记的淀粉样蛋白原纤维的形成通过亮场图像证实，并通过硫黄素T (ThT)共染色证实。这种常用的荧光染料与淀粉样蛋白原纤维特异性结合，并与DBOV-OTEG表现出良好的共定位(Pearson相关系数= 0.71)。SMLM可以分辨DBOV-OTEG标记的淀粉样蛋白原纤维，具有高分辨率和高信噪比，这在传统的宽视场图像中难以区分。SMLM的图像质量通常受到荧光团的亮度(光子数)和开-关占空比以及其标记密度的限制。在50 ms的曝光时间下，淀粉样蛋白原纤维的SMLM图像重建获得了2360的高平均光子数和每帧约20 nm的显著平均定位精度。此外，dbov - oteg标记的淀粉样蛋白原纤维可以在pH为1至13的水溶液中成像(支持视频2、3、4、5、6、7和8)，光子数和成像定位精度与在空气中测量的结果相当。这些结果证明了DBOV-OTEG的多功能性及其优于环境依赖的荧光团，例如Cy5, Cy5需要特殊的闪烁缓冲液和螺吡喃，而螺吡喃仅适用于紫外线照明的空气。
纳米石墨烯用于活细胞溶酶体的SMLM成像
SMLM能够以纳米级分辨率成像活细胞中的亚细胞结构/细胞器，只要它们的运动速度比成像速度慢。对于活细胞SMLM成像，除了最佳的闪烁特性外，荧光团还应具有低毒性和良好的细胞通透性。我们通过MTT实验证实了DBOVOTEG的低细胞毒性，表明长期活细胞成像的可能性。DBOV-OTEG也能够在U2OS细胞中穿过质膜，并在内吞后选择性地积累到溶酶体中，这一点通过与商业染料LysoTracker Green共标记得到证实。溶酶体是细胞内的多功能细胞器，在介导细胞代谢和信号传导中起着至关重要的作用，但它们的酸性微环境(pH 4.5 - 5)阻碍了典型的pH敏感荧光团的SMLM成像。值得注意的是，DBOV-OTEG具有不依赖ph值的闪烁特性，能够在适合活细胞研究的生理条件下，在标准细胞培养基中对活U2OS细胞中的溶酶体进行SMLM成像，无需任何添加剂或紫外线照射。以30 s为时间间隔监测溶酶体的动态运动和形态变化。一个细胞内三个亚区的时间序列超分辨率图像清楚地揭示了溶酶体在纳米尺度上的运动多样性。这些结果突出了DBOV-OTEG相对于最先进的SMLM溶酶体标记物的优势，其定位精度提高了1.5倍，荧光亮度提高了7倍，并且通过更低的占空比大大提高了成像定位和溶酶体动力学分析的准确性。不依赖于ph值的闪烁特性也可能通过其他纳米石墨烯的适当功能化来同时靶向和成像除溶酶体外的多个细胞器。
纳米石墨烯用于神经元全局新生蛋白的SMLM成像
为了实现DBOV的位点特异性标记，我们设计了具有三条三甘醇链的DBOV叠氮化物，以确保其水溶性和适合点击反应的叠氮化物残留物。DBOV-叠氮化物的闪烁性质与DBOV-OTEG相似。为了通过SMLM成像更深入地了解新生蛋白的合成，我们在背根神经节(DRG)感觉神经元中标记了新合成的新生多肽，方法是结合o -丙炔嘌呤霉素(OPP)，然后基于铜催化的叠氮化-炔环加成(CuAAC)与DBOV叠氮化反应。常规宽视场成像显示，荧光信号均匀分布在神经元细胞体和轴突内。DBOV -叠氮化物本身不与神经元内的其他生物分子发生反应，证实了dbov -叠氮化物对胞质蛋白和OPP的高选择性。在用OPP治疗神经元和随后与dbov -叠氮化物发生点击反应之前，用大霉素(另一种停止核糖体翻译并与OPP竞争的抗生素)处理神经元时，也可以观察到很少的标记，证实了OPP对新生蛋白的高标记选择性。与其他荧光成像技术相比，SMLM的独特优势之一是其固有的检测单个分子闪烁事件的能力。这些事件可用于研究，神经元新生蛋白的SMLM成像可以在PBS溶液中不添加任何添加剂，提供重建后的超分辨率图像。值得注意的是，SMLM成像使我们能够清楚地区分轴突分支中的三个蛋白簇，而这些蛋白簇在其相应的宽视场图像中无法分辨。为了获得神经元轴突内新生蛋白的详细图谱，我们进一步基于Voronoi图对所有定位数据进行聚类分析，该聚类分析可以有效地分割蛋白质簇，并计算出全局新生蛋白的局部密度和直径。Voronoi聚类分析显示，聚类的平均直径为50 nm，平均密度为2.5 × 104个定位/μm2。虽然常规的宽视场荧光成像显示分支点的局部平移程度大于分支间轴突片段的平移程度，但由于衍射极限的限制，无法准确分析平移焦点的数量及其簇大小分布。通过对SMLM图像的聚类分析，可以计算出分支点(多个轴突之间的交叉点)的平均点位/μm2(5.1个点位/μm2)，约为中间轴突片段(1.8个点位/μm2)的2.8倍。另一方面，分支点的平移焦点的簇大小和密度与轴突片段中的点相当。这些结果表明，轴突分支的局部翻译在合成蛋白质的数量方面更高，而翻译焦点的大小在整个网络中保持相似。
总结
亲水性、生物相容性和功能化的纳米石墨烯被合成为SRM应用的固有突发闪烁荧光团，成功地应用于空气和各种pH条件下的淀粉样蛋白原纤维成像以及生理条件下的活细胞成像， DBOV-OTEG具有优异的固有闪烁特性，不受成像缓冲条件、紫外光照射和pH的耦合，适用于从材料到活/固定细胞成像的各种超分辨率成像应用，并具有进一步探索材料功能和结构关系以及材料与生物系统相互作用的潜力。通过点击化学在PBS溶液中对dbov -叠氮化物标记的神经元的全局新生蛋白进行SMLM成像。SMLM独特的聚类分析可以在单分子水平上详细绘制神经元轴突的翻译活跃灶。对于感觉神经元轴突的全局局部翻译的可视化，这种分辨率之前尚未实现，并且它允许对这种生物现象进行更大的机制洞察，这对轴突生理学和病理学至关重要。
参考文献
Intrinsic Burst-Blinking Nanographenes for Super-Resolution Bioimaging， Xingfu Zhu, Qiang Chen ,Hao Zhao, Qiqi Yang, Goudappagouda, Márton Gelléri, Sandra Ritz, David Ng, Kaloian Koynov, Sapun H. Parekh, Venkatesh Kumar Chetty, Basant Kumar Thakur, Christoph Cremer, Katharina Landfester, Klaus Müllen, Marco Terenzio, Mischa Bonn,* Akimitsu Narita,* Xiaomin Liu*，J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5195−5203，https://doi.org/10.1021/jacs.3c11152
