内容提要
大多数聚集诱导发射(AIE)发光物质具有高亮度、优异的光稳定性和良好的生物相容性，但这些AIE活性物质在受激发射耗尽(STED)超分辨率成像和光动力治疗(PDT)中目前还没有报道。为了满足STED纳米显微镜和PDT的要求，通过调整π共轭，设计了D-A-π-A-D型DTPABT-HP，具有红移发射、高达32.04%的PLQY和1O2生成(比RB高9.24倍)。通过STED纳米显微镜将DTPABT-HP NPs应用于细胞成像，特别是以超高分辨率可视化PDT过程中溶酶体的动态变化。通过DTPABT-HP NPs在体内进行PDT，显著抑制肿瘤生长，抑制率为86%。
实验结果与讨论
分子的设计合成与光物理性质研究
以三苯胺(TPA)和苯并噻唑(BT)为单元，首次合成了TPABT。然后加入吲哚二噻吩单元(IDT)制备D-A-π-A-D型DTPABT-H和DTPABT-HP。首先用紫外-可见光谱和光致发光光谱(PL)表征了TPABT、DTPABT-H和DTPABT-HP的光物理性质。通过在骨架中插入π间隔剂，可以观察到DTPABT-H和DTPABT-HP的红移发射。当首先加入水时，由于黑暗扭曲分子内相互作用(TICT)状态，所有分子的荧光强度都降低了。这也可以通过它们在不同极性溶剂中的PL光谱来证明。形成聚集体后，DTPABT-H仍有淬灭发射，而TPABT和DTPABT-HP均有恢复发射。这是由于RIM机制和对TICT状态的抑制另外，固态荧光光谱记录在图中。与它们的AIE特性相似，DTPABTH的发射特性较差，而TPABT和DTPABT-HP的发射特性较高。结果表明，四氢呋喃中DTPABT-H的PLQY值为28.34%，远高于固体中的1.87%。然而，在TPABT和DTPABT-HP的情况下，在固体中获得了显著增强的发射，导致PLQYs分别高达30.25%和23.09%。TPABT和DTPABT-HP在聚集体中都比DTPABT-H具有更大的kr值，因此具有优异的荧光性能。
DTPABT-HP NPs的体外光动力学治疗研究
为了提高纳米颗粒在水中的分散性和生物相容性，采用纳米沉淀法制备纳米颗粒。透射电子显微镜(TEM)图像也被捕获，显示均匀的球形形貌。此外，还研究了这些NPs的荧光性质。观察到DTPABT-HP NPs仍然获得了覆盖600至850 nm的有效发射。其亮度远高于其他两种情况，导致PLQYs值为32.04%)。DTPABT-HP NPs在水中和不同pH值的PBS溶液中分散7天以上，通过DLS和PL进一步表征，显示出较高的胶体稳定性和荧光稳定性。本文以氯e6 (Ce6)为对照物，以9,10-二甲基蒽(DMA)为指示剂。可以看出，与含有TPABT、DTPABT-H和DTPABT-HP的溶液相比，Ce6在光照射下发生了信号丢失。这表明溶液中Ce6的O2生成水平很高。然而，在NPs中观察到完全不同的现象，dtppt - hp NPs显示出明显的减少DMA排放的能力。1与RB相比，TPABT、DTPABTH和DTPABT-HP NPs的O2效率分别为1.82倍、3.65倍和9.24倍，DTPABT-HP NPs的1O2生产效率也远高于大多数报道的PPs。DTPABT-HP NPs的优异性能主要得益于其庞大的π桥结构，限制了分子内的运动，促进了系统间从单线态向三重态的跨越。3 ' -(对羟基苯基)荧光素(HPF)和3 ' -(对氨基苯基)荧光素(APF)也用于评估·OH的生成。对于HPF组和APF组，在DTPABT-HP NPs存在的情况下，荧光强度增强。为了进一步验证它们的·OH生成，使用5,5-二甲基-1-吡咯啉n -氧化物(DMPO)来评估自由基的形成。在电子顺磁共振(EPR)光谱中发现，含有DTPABT-HP NPs和DMPO的溶液在辐照下产生较强的信号，与自由基(I型ROS)的产生有关。这表明dtppt - hp NPs可以同时产生·OH和1O2，从而实现高效的PDT效果。然后，探讨DTPABT-HP NPs的光疗效果。首先进行CCK-8活力测定。使用DTPABT-HP NPs (100 μg·mL−1)处理4T1细胞后，在黑暗条件下存活率保持在~ 85%，表明其具有良好的生物相容性。然而，在白光照射下，细胞活力随着浓度的增加而逐渐下降，表明PDT具有剂量依赖性的光毒性。为了了解细胞杀伤，我们研究了DTPABT-HP NPs在细胞中的分布和ROS的产生。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)，通过DTPABT-HP NPs在HeLa细胞中获得了明显的荧光，而LysoTracker green和Hoechst 33342分别观察到绿色和蓝色信号。值得注意的是，DTPABT-HP NPs和LysoTracker Green的信号可以记录到很好的重叠，Pearson相关系数高达94%，表明它们具有良好的溶酶体靶向性。采用荧光成像和流式细胞术检测细胞内ROS水平。在对照组中检测到Calcein-AM(活细胞绿色)，但在照射(100 mW·cm-2,10 min)后，DTPABT-HP NPs处理的HeLa细胞通过PI呈现死亡状态，这也与CCK-8实验的结果一致。
DTPABT-HP NPs超分辨荧光成像研究
由于DTPABT-HP NPs的高效发射，通过STED纳米显微镜研究了其在SRI中的应用。耗尽光束被确定为775 nm, 然后研究了dtppt - hp NPs的光稳定性，并列出了Alexa Fluor488 phalloidin对靶细胞骨架的比较首先，制备相同浓度(10 μM)的Alexa Fluor488 phalloidin和DTPABT-HP溶液。然后，将这些样品辐照，在DTPABT-HP中产生更高的光稳定性。在细胞中也出现了类似的结果，在STED光束(592 nm, 100 mW)照射下，Alexa Fluor488的荧光强度严重下降，但DTPABT-HP NPs的信号保持在91%左右(775 nm, 100 mW)。此外，为了研究其饱和功率密度(Psat)，在不同功率(激发束:480 nm;耗尽光束:775 nm)。结果表明，Psat值为50mw。这比其他深红色发射体要好得多。然后，通过STED纳米显微镜对高分辨率的DTPABT-HP NPs在活细胞中进行溶酶体特异性成像。在STED纳米显微镜下，可以清楚地识别它。这可以很容易地从它们相应的放大视图中得到。然后，沿着图C和D所示的线的荧光强度分布也进行了研究，根据它们的半最大值全宽度(FWHM)值， STED纳米显微镜(FWHM = 102和114 nm)的分辨率远高于CLSMs (FWHM = 345 nm)。然后，利用dtppt - hp NPs在超溶液下观察活细胞中的PDT过程。在STED纳米显微镜下，除了DTPABT-HP NPs染色的溶酶体外，微管也被Tubulin Tracker Green标记。这可以作为超分辨率成像的概念验证目标。对于用DTPABT-HP NPs和Tubulin Tracker Green处理的HeLa细胞，可以通过缩小的FWHM值清楚地捕获其详细结构，特别是微管中的线状模式。然而，值得注意的是，dtppt - hp np处理的HeLa细胞在光照射下会产生ROS，从而产生高效的PDT。这也被STED纳米显微镜记录下来。亚细胞形态发生明显变化，包括膜破裂和微管断裂。特别是，相对于它们的精细结构，得到了塌陷的微管。可以清楚地观察到，在PDT过程中，dtppt - hp np染色的溶酶体仍然可以获得FWHM值为~ 200 nm的优异成像分辨率。
DTPABT-HP NPs体内光动力学治疗研究
将DTPABT-HP NPs静脉注射到4T1荷瘤裸鼠体内。其荧光强度逐渐增强，在注射后9 h达到最大值。注射后36小时，荧光信号仍然存在于肿瘤部位。它们在不同时间对应的荧光强度也绘制在图中。此外，我们还切除了主要器官和肿瘤进行离体成像，结果显示DTPABT-HP NPs主要积聚在肿瘤、肝脏和脾脏。此外，我们在健康的BALB/C小鼠中探索了DTPABTHP - hp NPS的药代动力学，其中血液中DTPABTHP NPS的浓度逐渐下降，在24 h时降至3%。这种显著的保留和积累表明DTPABT-HP NPs有利于进行癌症诊断和其他后续治疗。PDT原理图如图所示。将4T1荷瘤小鼠(约50 mm3)分为5组:(1)PBS， (2) PBS + Laser， (3) DTPABT-HP NPs， (4) Ce6 + Laser， (5) DTPABT-HP NPs + Laser。为了评估PDT的效果，在尾静脉注射9 h后，用150mw·cm−1的白色激光照射肿瘤部位10分钟，每2天测量一次体积。我们注意到DTPABTHP NPs + Laser和Ce6 + Laser对肿瘤生长有很好的抑制作用，而其他组肿瘤生长明显。特别是，DTPABT-HP NPs的肿瘤抑制率为86%。同时记录各组小鼠的体重。可以看到Ce6 + Laser组的体重略有下降，但其他组的体重也有类似的增长趋势。14天后的肿瘤图像也验证了这些结果，显示了良好的体内PDT效果。“dtppt - hp NPs +激光”组的肿瘤切片在DHE下也显示出较强的荧光，证明了PDT在体内的作用。
总结
综上所述，合成了DTPABT-HP的D-A-π-A-D型AIEgen，增强了其亮度、ROS生成和红移发射的所有通道。dtppt - hp在NPs中表现出600 ~ 850 nm范围内的红移发光，PLQY值高达32.04%，并且具有良好的1O2生成能力。这些结果表明，dtppt - hp可以同时很好地满足PDT和STED纳米显微镜的要求。通过一个AIEgen在超分辨率成像和PDT中都有应用，这意味着它在光疗方面有很大的潜力。
参考文献
One Stone, Two Birds: High-Brightness Aggregation-Induced Emission Photosensitizers for Super-Resolution Imaging and Photodynamic Therapy， Zhi Wang, Yu Zhou, Ying Hao, Zhiqin Zhao, Anran Gao, Huili Ma,* Peijuan Zhang, Qifei Shen, Ruohan Xu, Yanzi Xu, Dongfeng Dang,* and Lingjie Meng*，Nano Lett. 2024, 24, 3005−3013, https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c04099
