内容提要
脂滴在脂质代谢、膜生物合成、细胞能量平衡、信号通路等方面发挥着至关重要的作用。LD功能障碍与许多疾病有关，如肥胖、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化和癌症。本综述系统总结自2021年以来针对LD的最新小分子探针，旨在为上述未解决的关于LD的关键科学问题提供有用的见解我们的重点是以下工具:1) 高特异性荧光探针，用于观察LD及其在生理和病理条件下的相互作用，使用普通共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)或超分辨率技术; 2)LD靶向光动力光敏剂和新型降解剂。我们希望这篇综述能够为读者提供新的见解:脂滴动力学的生物学本质，LD相关疾病的分子机制，LD靶向光敏剂和降解剂的潜力。
能够监测LD接触的分子探针
很明显LD与细胞其他部分(如内质网(ER)、线粒体、过氧化物酶体和溶酶体)之间的串扰是广泛的。这些相互接触与各种生理过程高度相关。开发单一的、可靠的、时空敏感的荧光探针，能够在表型和/或蛋白质组学水平上检测LD相互作用，并最终应用于体内疾病模型，是迫切需要的。
分子探针成像LD和ER串联
LD与ER的相互作用尤其丰富，因为LD被认为起源于中性脂质合成所需的大多数酶所在的ER。为了可视化LD与ER之间的相互作用，Guo等人利用单荧光探针的策略对两个细胞器同时进行双色成像。他们以激发态分子内质子转移(ESIPT)性能优异的3-羟基黄酮为骨架。将亲脂性和给电子能力不同的各种基团进一步引入3-羟基黄酮的侧位，首次生成单荧光探针2 (PPC)和3 (EPC)，可同时对LD和ER进行双色成像。由于ER是一个由膜封闭小管组成的网络，内质网相关酶合成绝大多数细胞脂质，LD和ER内的类脂性为具有合适亲脂性的探针2/3同时定位在这两个细胞器内提供了独特的机会。重要的是，它们显著不同的含水量使得使用单个荧光探针对LD和ER进行潜在的独特荧光成像。当2/3处于几乎不含水的LD中时，3-羟黄酮片段可以形成基于氢键的分子内环。因此，新形态探针的整体极性降低，但对LD的注视能力增强，导致ESIPT效应增强，橙色荧光开启。然而，当探针处于含水量非常高的ER中时，由于水的溶剂效应，氢键会被阻断。因此，ESIPT效应被绿色荧光打断。2/3能够研究其形态、大小在LD和ER在活细胞和组织中的分布。单探针2/3的双色成像能力使得在ER区附近成功观察到新生LD，进一步支持LD起源于ER区的假设。基于esipt的探针2/3的开创性分子设计策略也为开发用于LD和其他细胞器同时双色成像的单荧光探针提供了新的见解。虽然探针2/3很有希望，但不同发射波长的橙色和绿色荧光信号可能存在串扰，这可能会影响LDs-ER相互作用的精确表征。为了克服这一限制，Tian及其同事合成了一种强大的单荧光探针4a (DCTX)，用于区分双发射通道中的ER和LD。4a是通过将罗丹明染料(其开/闭形式对水敏感)与亲脂香豆素部分偶联而设计的。探针以开环形式存在于含水的ER中。与探针2/3相比，4a的共轭体系要大得多，这使得4a能够在近红外区域(820 nm)发射。而当定位到疏水LD时，它显示闭环形式4b。这种改变中断了4b的共轭系统，因此只有香豆素部分在500 nm处发出绿色荧光。封闭和开放形式之间明显不同的发射波长(320 nm位移)导致这些双发射通道之间的串扰可以忽略不计。通过使用这种独特的探针，在用不同浓度的油酸、胆固醇和硬脂酸处理的细胞中成功观察到脂质积累。研究还发现，环境温度的改变和缺氧刺激可引起活细胞LD的变化。4a的零串扰性能源于一个大的共轭体系，可以从各种组织中清晰地描述细胞环境中的LD和ER。因此，4a可以作为研究疾病环境中LD-ER相互作用的强大分子工具。另一种设计单个荧光探针的方法是通过将两个不同的细胞器靶向部分结合到一个分子中，从而能够同时对两个细胞器进行判别和可视化。与响应环境线索的被动开环或闭环策略不同，主动靶向策略使设计探针能够更精确地定位在所研究的细胞器中。它可以提高LDs -细胞器相互作用表征的精度。孟等人通过将甲基磺胺(ER靶向)和二甲胺(LD靶向)基团结合到1,8-萘酰亚胺荧光团的两端，开发了探针5 (LDER)。5表现出典型的分子内电荷转移(ICT)效应，具有极性敏感性。由于极性差异很大，它可以快速定位到LD和ER，并能够对这两种细胞器进行判别荧光可视化。使用相同的策略，Hickey等人报道了一种非常相似的探针6 (DMN-DT)，用于同时成像活细胞中的LD和ER。不同之处在于，基于他们之前发现的3,4-二甲氧基-1,8-萘酰亚胺作为LD特异性探针，他们使用了3,4-二甲氧基而不是二甲氨基基作为供体。6比5对环境极性更敏感，这使得它在ER和LD中分别发出绿色和蓝色。同时，研究表明含氟取代芳基的荧光团对ER内的生物分子具有很高的亲和力。为了进一步增强探针靶向ER的能力，Mansuri等人报道了将五氟苯乙腈与香豆素荧光团结合的D-π-A探针7 (PFC)。7表现出更好的ER靶向性能，以及不同荧光强度下对ER和LD的区分能力增强。探针5-7也通过监测ER的相互作用成功地观察到LD的产生。最近，Dai等人新合成了一种极性敏感(分别在570/625 nm在1,4-二恶烷和70%水/1,4-二恶烷中发射)探针，8 (LP)，具有D-A-D构象。利用探针8的极性敏感特性，进一步应用于LD (λ em = 500-550 nm)和ER (λ em = 570-620 nm)的判别荧光成像。通过探针8，发现饥饿条件下ER和LD的数量都减少了。然而，探针8在其他细胞器中的定位并没有得到充分证明。
分子探针成像LD和线粒体串联
线粒体作为细胞的“能量工厂”，在高代谢率的细胞(如心肌细胞、骨骼肌细胞等)中，作为能量储存中心，与LD紧密沟通。由于线粒体膜携带高度负电荷，线粒体特异性探针通常携带阳离子，如三苯磷(TPP+)、N+和O+。然而，这些阳离子通常与LD的非极性环境不相容，从而促进特定的化学反应，如亲核加成成为中性。基于这一原理，Li等人开发了一种双靶向双色荧光探针9a (Mito-LD)，通过将吲哚胺衍生物偶联到香豆素部分上，用于同时检测线粒体和LD。与上述LDs-ER串扰的被动靶向策略类似，9a在高极性环境中以带正电的开环形式存在，并通过静电吸引靶向线粒体;当处于LD的低极性环境中时，它通过亲核加成转变为更疏水的闭环形式，从而实现LD-targeting(9b)。化学结构的改变导致线粒体和LD同时定位。当9a在线粒体中时，由于吲哚胺阳离子和香豆素部分之间典型的推拉系统而发出红色。相比之下，9b在LD中，由于亲核加成后共轭降低，发出绿色。这种转变导致最大发射波长(190nm)发生了显著的蓝移。该探针成功地同时产生线粒体和LD的双色图像。利用9a，他们发现低密度脂蛋白(LDL)吞噬后，细胞内LD的数量和大小显著增加，线粒体与LD之间的物理接触增加，共定位系数从0.23变为0.87。这可能与更高的能量需求有关。他们的研究证明了用单个荧光探针实时监测LD -线粒体相互作用的可行性。然而，值得注意的是，Feng小组最近报道了一种结构类似的荧光探针10a (ICM)。基于相同的原理，它同时针对线粒体和LD。有趣的是，它也可以定位于溶酶体，与线粒体中的波长相同，但荧光强度不同。这样的特征使得这三种细胞器可以同时染色。9a和10a的性能不同，但具有相似的结构和可逆环化策略，这表明需要仔细验证设计探针的定位。另一种实现探针从阳离子型向非离子型转变的方法是通过细胞内酶/化学反应催化的自发消除。例如，在不同的聚集诱导发光材料(AIEgen)中，Dong基团和Li基团将乙酰氧基作为酯酶激活位点，通过自燃烧连接体连接到吡啶的N原子上，产生带正电荷的探针11a (Mito-TTPE)和12a (NAP-Py-E)。基于电荷相互作用，这两种探针可以定位到具有红色发光的线粒体。然而，11a/12a的乙酰氧基可以在细胞内被酯酶水解。随后的1,6-消除反应产生了中性形式的11b /12b产物，从而基于其良好的脂溶性促进了与LD的结合。11b /12b，在LD中，分别发出蓝色和绿色荧光。11a/12a双靶向的原理也被证实，当它们与死细胞孵育时，没有LD染色，酯酶活性被抑制。因此，探针11a & 12a也可用于检测细胞活力。与可逆的分子内环化策略相比，这种基于酶促反应的策略是不可逆的，可以提供酶活性和LD接触之间的联系。这些信息对于理解细胞状态的转变是有价值的，并且可以用于有针对性的干预来转换细胞命运的决定。最近，Li等人基于类似的原理，开发了线粒体和LD双靶向探针13a (TSQC)，通过使用响应细胞内半胱氨酸的丙烯酸酯来获得13b。虽然这些探针在特定刺激下研究线粒体和LD之间的接触是智能的，但仍然存在一些局限性。首先，染色时间长。其次，对乙酰氧基或丙烯酸酯的反应选择性值得关注。例如，丙烯酸酯可能容易受到酯酶活性的影响。
分子探针成像LD和溶酶体串联
溶酶体是一种酸性(pH值= 4.5-5)的消化细胞器，含有50多种水解酶(如蛋白酶、脂肪酶和核酸酶等)。利用天然碱基morpholine作为溶酶体的靶向片段已经得到证实。与探针4的设计策略类似，孟等人通过将溶酶体靶向的morpholine引入到LD靶向的1,8-萘酰亚胺荧光团中，合成了双细胞器靶向探针17 (LD-Lys)。这样两个靶向部分的结合使得17在溶酶体和LD中同时定位。17在基于扭曲分子内电荷转移(TICT)效应的LD中显示出亮黄色荧光发射(592 nm)，而在具有更高极性的溶酶体中显示出红色荧光发射(628 nm)。虽然溶酶体中的17个发射光谱的波段最大值与LD之间的差异不显著。由于LD的荧光强度增强，17仍然能够区分这两个细胞器的信号。使用程度不同的17，可以观察到肝、肺、肾、心、脾等组织中LD与ER的相互作用。还需要指出的是，溶酶体中微弱的荧光信号可能导致监测LD和溶酶体相互作用的低至中等灵敏度。为了开发一个实时监测LD与溶酶体之间相互作用的平台，特别是在脂质吞噬过程中，庄等人开发了一种ph响应比例双色AIE探针，18 (LD-L)，用于染色LD和溶酶体。他们的设计基于ICT效应，其中N,N-二氨基单元与四氟苯基取代吡唑啉基荧光基团缀合质子化前后的电子供能能力差异很大。该探针在LD中的最大发射波长为570 nm。然而，溶酶体中的探针质子化有效地阻断了ICT效应，导致最大发射波长(475 nm)发生了95 nm的蓝移。这使得实时监测和定量的pH变化的LD在脂质吞噬与比例荧光模式。通过监测LD -溶酶体与18的相互作用，也成功地检测了脂噬的动力学。使用类似的策略，Dai等人利用喹啉的弱碱性构建了LD和溶酶体双色探针19 (CAQ2)。当溶酶体的质子与19结合后，推拉偶联系统得到增强。这又导致了从蓝色荧光到红色荧光的转变。重要的是，19能够监测自噬，由于自噬过程中溶酶体的酸化，红色发射显著增加。相比之下，19在细胞凋亡过程中由于溶酶体的碱化而显示出红色发射减少。这种区别性的发射颜色使19能够区分细胞凋亡和自噬。在这些基础上，Hu等人巧妙地使用了啉作为电子供体，并将其引入到杂蒽荧光团中，生成探针20 (LD-H-Lyso)。由于morpholine容易质子化和xanthene的疏水性，20表现出优异的靶向LD和ER的能力，使其成为一种非常有前途的双靶向双色探针。
基于LD膜蛋白的LD接触跟踪分子探针
嵌入在LD磷脂单层中的LD蛋白在LD功能中起核心作用，并介导LD接触。蛋白质主要通过疏水发夹、两亲α-螺旋、疏水富序列和修饰等途径定位于LD。而LD蛋白的其余部分则暴露于亲水性细胞质中环境。Kong等人提出了一种新的化学标记策略，并基于LD膜蛋白设计了探针24a (LDM)。首先，24a的亲脂性使其能够以绿色荧光发射进入脂滴中。随后，24a的N,N-二甲基硫氨基甲酸酯基与HClO/ClO−aroundLD发生反应，导致保护基团的去除，生成24b (LDM-OH)。24b上的羟基与LD膜蛋白上的氨基酸残基静电相互作用后，24b可以与LD膜结合。这些串联过程有助于实现24b用红色荧光对LD膜的有效标记。24b的标记模式不同于以往用于监测LD接触的单荧光探针，后者通常基于亲脂性定位于LD的脂质核心。利用24a，揭示了LD与线粒体接触的动力学机制和蛋白质积累参数。这种新颖的策略可以提供LD蛋白的实时监测，直接定量测量膜蛋白密度，更精确地监测LD接触。
LD的超分辨率动态跟踪
LD经常与其他细胞膜结构接触，即使在给定的细胞中，其大小也会变化。准确分析LD的异质性及其在特定细胞事件中的动态通信和相应的接触位点对于理解LD的生物发生及其在健康和疾病中的功能至关重要。因此，具有高保真质量的高分辨率LD成像是非常必要的。由于光衍射极限的限制，传统共聚焦显微镜的成像分辨率通常限制在250 nm左右。因此，一些小LD的信号，特别是那些新生的LD(直径~ 20-40 nm)及其相互作用可能会被遗漏或假阳性。超分辨率成像(SRI)是一个快速发展的领域，它能够分辨低于光学分辨率的传统衍射极限的物体，从而允许在细胞环境中以数十纳米分辨率研究动态过程。该技术能够更全面地描述异质LD，特别是对于小的新生LD，以完善关于LD生物发生和分解的更详细的动力学数据。
LD SIM荧光成像
SIM属于宽视场荧光显微镜。原理上，光线从一个精细的网格结构以不同的角度投射到样品上。随后，在荧光团存在的区域产生包含不同信息的干涉图案。最后，通过这些图案的算法叠加可以生成高分辨率图像，分辨率可达约100 nm。使用具有优异的抗光漂白性能的荧光团将是首选。与传统的宽视场荧光显微镜相比，SIM具有成像速度快、样品制备简单等优点。
光漂白是由共价键断裂或染料与周围分子之间的非特异性反应引起的，这限制了荧光团在LD动力学研究中的应用。由于对SIM抗光漂白特性的要求越来越高，为了满足LD超分辨成像的需要，人们努力开发各种策略的分子探针。最近，Xu组采用缓冲池策略，设计了一种氢键敏感LDs特异性探针25 (LD-FG)。当探针在LD外，即在含有大量水的细胞质溶胶中，与水形成的氢键使荧光猝灭。当它在LD内部发出荧光时。有趣的是，研究人员提出了一种“缓冲池”理论，其中LD外的完整探针分子可以不断地取代光漂白的探针。相应地，光漂白可以被挽救，这使得它能够可视化动态LD聚结。实际上，探针25可以用于LD动态的长期SIM荧光成像。利用这种方法，揭示了两种LD聚结模型。他们发现多个LD甚至两个不相邻的LD可以融合形成一个新的LD。25能够监测LD的生长和收缩、非均质性、融合和相互作用，这归因于其超强的抗光漂白性能。这样的功能性探针对于研究疾病环境下的LD动力学是绝对有用的。然而，局限性仍然存在。根据缓冲池策略的原理，可以推测，减少目标位置的探针数量，增加周围探针数量，将导致更大的长期成像缓冲能力。然而，不可忽视的是，目标位置探针数量的减少可能会导致荧光信号的降低。为了实现高荧光强度和良好缓冲能力的超分辨率成像，研究人员进一步使用荧光亮度高的探针26 (BODIPY 493)对LD进行SIM成像。26的亮度是25的5倍，这是由于LD中的高分子积累。他们的工作表明，荧光探针的缓冲能力和亮度应该协调一致。2024年，Xu小组基于“缓冲池”策略对探头进行了重新设计，开发了一种新的SIM成像缓冲探头27 (LD-CF)。该探针的设计方法是在探针25的框架中加入两个强吸电子的三氟甲基基团。这种修饰有助于提高探针对极性的灵敏度。由于探针的极性灵敏度，它在LD外显示绿色发射，在LD内显示蓝色发射。背景荧光通过“青色滤光片”策略消除，使LD免水洗成像成为可能。由于“缓冲单元策略”的实施，探针还能够实现光稳定的长期SIM成像。利用该探针，观察了三种LD融合模式，包括从大脂滴到小脂滴的融合模式。迄今为止，缓冲池策略已被证明是LD SIM成像的一种简单有效的策略。此外，Xu团队最近的研究表明，Clog P值在2.5 ~ 4之间的小分子可以在LD外形成缓冲池，这也为该策略的扩展应用提供了基础。
LDS的STED荧光成像
STED突破了传统的光学衍射极限，使用了两束功能不同的共列激光束。其中一束用于将荧光团从基态S0激发到激发态S1;另一个，称为STED光束具有零强度点在中心，被应用于淬灭荧光团位于外围的激发区域。STED的分辨率一般受STED光束猝灭能力的影响。根据施加功率的不同，横向分辨率通常可以达到30-100 nm。用于STED成像的良好发光材料通常要求具有良好的耐光漂白性，高荧光量子产率，吸收光谱和发射光谱之间的重叠最小。由于STED不需要对图像进行后处理，因此具有成像速度快、分辨率高的优点。STED成像的要求使得STED荧光探针的开发具有挑战性。最近，Zhou等人开发了一种LD靶向探针，30 (Lipi-DSB)，用于基于二苯基苯结构的STED成像。两个强吸电子氰基的引入显著降低了HOMO/LUMO能级，从而提高了光稳定性。在660 nm处测得的饱和强度为10.1 MWcm−2，低于金标准STED成像探头ATTO 647 N (10-20 MWcm−2))。此外，D-A-D分子骨架在HOMO到LUMO跃迁之间保持了1.66的大振荡强度，使探针具有高量子产率(在甲苯中为0.97)。他们的研究结果表明，即使在连续拍摄50张共聚焦照片后，仍能保留91%的初始荧光强度。然而，对于商业染料Nile Red，仅能保持22%的荧光强度，说明30的光稳定性非常好。使用30，实现了58 nm的LD STED成像的高分辨率，实现了1000帧的延时成像。利用该探针首次观察到了初生LD的聚变过程。同样，他们通过在探针30中引入二甲氧基进一步获得了探针31 (Lipi-DSBOMe)。660nm的耗尽激光可以使其完全耗尽，提高了耗尽效率，并将饱和强度降低到0.96 MWcm−2。31时，LD的最高成像分辨率为42 nm。在进一步的步骤中，本研究组利用苯二噻吩-四氧化物结构获得了另一种STED LD探针32 (Lipi-BDTO)。其HOMO到LUMO的跃迁保持了0.984的大振荡强度。32在甲苯中的荧光量子产率为0.98，在660 nm耗尽光下测量的饱和强度为6.8 MWcm−2。使用16 MWcm−2耗尽光强度实现65 nm高分辨率LD成像。这些探针显示了STED在研究LD动力学方面的潜力。值得注意的是，目前LD的STED使用量低于SIM，这可能是由于对STED设计探头的光物理特性要求严格造成的。为了最大限度地利用SETD进行LD研究，需要更多的努力来制定更有效和通用的STED荧光探针设计策略。
疾病环境中LD的检测
作为脂质代谢中枢，LD失调与许多疾病有关。例如，在肥胖、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、糖尿病、糖尿病肾病和透明细胞肾细胞癌(ccRCC)中，通常可以观察到LD的异常积累。而缺乏LD或脂质会导致脂肪营养不良。而且这些潜伏期长、治疗困难的LD相关疾病的患病率在过去十年中有所上升，对人类的生命和健康构成了重大风险。然而，目前尚不清楚1)LD的改变是症状性的还是病因性的，2)除了LD数量和大小的改变外，LD蛋白质组和脂质的组成是否以及如何改变。因此，我们用一个单独的章节来总结最近在疾病环境中用于LD的小分子探针，希望对以下方面提供有用的见解:1) LD在疾病发生和进展中的作用;2) 基于LD的数量、大小、接触、脂质和蛋白质组的改变，LD靶向探针的早期诊断潜力;3) LD靶向药物的发现，4)更强大的LD靶向化学探针的开发。
NAFLD的LD探针
NAFLD是肝脏疾病致残和死亡的主要原因。并且与其他代谢综合征如II型糖尿病密切相关。作为哺乳动物的代谢中心，肝脏中脂质异常积聚导致肝脏脂肪变性、炎症和损伤，进而引起NAFLD相关代谢综合征，最终发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。不幸的是，NAFLD作为一种异质性疾病的预后是困难的。已经证明的是LD在肝细胞炎症和纤维化中起重要作用。因此，利用LD靶向探针对NAFLD的潜在早期诊断具有重要意义。
Fan等人开发了一种极性敏感的LDs特异性探针35 (LD-TTP，)，该探针由吡啶作为电子-组成受体和三苯胺作为电子给体形成典型的D-π-A构型。研究人员发现，探针35在脂肪肝模型中显示出比正常组高得多的荧光强度。提示NAFLD细胞LD的极性与正常细胞不同，这可能是由于LD内脂质组成发生变化所致。更重要的是，这一结果也为利用LD极性检测脂肪肝开辟了新的途径。在另一项研究中，Wu等人利用他们新合成的亲脂性探针36证实了大尺寸LD在脂肪肝模型小鼠肝组织中的异常积累(ANI）。基于表观极性依赖性质和高对比度LD成像，他们的探针可以以免水洗的方式应用。这种性能可能归因于该探针中存在的二甲胺和甲氧基官能团的双重电子给体效应，这导致了明显的ICT效应和出色的极性敏感特性。随后，开发了几种具有类似功能的荧光探针。Lai等人利用探针37 (CCB)通过量化脂肪变性LD极性来评估NAFLD。此外，聚合诱导发射的策略也可用于构建此类功能探针。Huang等人利用香豆素片段和二苯胺转子构建了具有AIE特性的探针38(唇形yb)，实现了超高信噪比和免洗性能。后来，为了开发临床可用的探针，用于潜在的NAFLD早期诊断，开发了具有双光子和NIR-II特性的39/40/41。这些探针能够执行LD的长期，高分辨率，低背景荧光成像。它们还能够深入渗透到活体样品中，同时确保最小的自身荧光和光损伤，为脂肪肝非侵入性诊断试剂的开发奠定了基础。值得一提的是，41具有显著的双光子截面(Φδmax>600 GM)和优异的LD特异性和光稳定性，不仅可以评估NAFLD的分期，还可以清晰地显示肝损伤模型中两个LD之间的融合过程。有趣的是，Puresvuren等人开发的Ir (III)复合物探针42 (BTP)的磷光寿命可用于量化LD中的氧水平。他们的结果表明，脂质积累的肝细胞存在部分缺氧。此外，为了研究NAFLD与药物性肝损伤(DILI)之间的关系，Wang等人利用过氧亚硝酸盐(ONOO−)作为肝损伤早期诊断的生物标志物，合成探针43(MBDP-Pyþ)。将硼酸苄酯组引入到LD靶向染料BODIPY中，作为对抗ONOO−的触发器。43能够同时检测NAFLD和药物性肝损伤。结果提示，DILI与NAFLD的相互作用可能导致氧化应激加重，导致更严重的肝损害。
LD探针在心血管疾病中的应用
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性炎症性疾病，通常由动脉内斑块(由脂质组成)聚集引起。这导致血管壁硬化和管腔变窄，进而引起一系列心血管疾病(cvd)，包括缺血性卒中、心肌梗死和周围血管疾病。巨噬细胞现在被认为是AS形成的主要参与者。如果巨噬细胞过量摄取ox-LDL，会产生大量的LD，导致泡沫细胞的形成。这也是AS进展的标志。因此，LD被认为是as诊断的潜在标志。最近，Li等人通过将硝基苯并恶二唑与三苯胺偶联，开发了一种LD特异性探针44 (TNBD)。44可用于AS成像，通过检测LD。为了开发一种可用于AS术中荧光成像的造影剂，Sang等人通过香豆素和苯并噻唑偶联构建了化学探针45 (CN-PD)。45由于体积小，亲脂性高，可以快速定位动脉粥样硬化斑块。使用喷雾技术可以加速45进入斑块的渗透，可在5分钟内通过原位喷涂实现术中成像。为了进一步提高原位喷涂的递送效率，研究人员进一步合成探针46，将哌啶组替换为二乙胺组(CN-N2)。46可以浸泡在贴片中，并应用于AS组织的外表面，再次允许在5分钟内对斑块进行稳定的荧光成像。此外，它还显示出斑块/正常比率(P/N)的显著增强，可以准确描绘直径小至< 0.5 mm的斑块。这两种造影剂的成功开发为结合探针设计和高效原位递送的策略提供了理论基础。这一策略也为术中斑块荧光成像的临床应用带来了希望。
Liu等人设计了一种基于三苯胺(TPA)的荧光探针47 (PyTPA-LD)，将吡啶的亲水部分与肉桂酸甲酯的疏水部分结合在一起。使用47跟踪AS期间泡沫细胞内LD的形成，发现1)泡沫细胞早期由于脂质吞噬作用，LD增加;2)在后期，脂质吞噬与LD生成之间的平衡被破坏，溶酶体功能下降，导致LD过度积累，导致泡沫细胞的形成。这一化学工具为了解AS的致病机制提供了重要的见解。然后，Li等人采用可逆环化策略设计了极性和ph响应探针48a (BSJD)，用于溶酶体和LD的双色成像。使用48a，可以更清楚地观察到泡沫细胞形成过程中早期脂质吞噬的激活和晚期脂质吞噬的抑制。同时，也证明了脂质吞噬在调节脂质代谢和抑制泡沫细胞形成中的重要作用。由于泡沫细胞中LD的异常积累是明显的，一般的LD特异性探针可以很容易地检测到增加的LD。需要注意的是，在正常细胞中也有一些LD。如何将正常细胞与与AS相关的泡沫细胞区分开来，是人们非常关注的问题。为了提高临床跟踪的可靠性，需要对AS相关泡沫细胞具有更高选择性的化学探针。因此，Liu组彻底改变了BODIPY 493/ 503的结构，获得了一种LD-tracker 49a (MTB-B-CF3)，用于高选择性地染色动脉粥样硬化斑块。为了提高动脉粥样硬化斑块染色的特异性，他们引入了亲脂性的双(三氟甲基)苯基和对甲基硫代苯基片段作为HClO对BODIPY 493/503结构的反应位点。与HClO反应后，形成发射49b。其亲脂性增强，LDs靶向能力增强。更重要的是，由于泡沫细胞中HClO的表达水平远高于正常细胞，因此染色动脉粥样硬化的特异性明显增加。高特异性使得检测动脉粥样硬化斑块的双靶点策略颇具吸引力。除了HClO，其他活性氧如ONOO−were也被观察到在as中过量产生。随后，Sang等人使用类似的策略合成了双分析物顺序激活的基于逻辑门的荧光探针，50a (CNN2-B)和51a (CNP2-B)，并具有临床应用。通过ONOO−去除硼酸酯和结合的连接物后，原位生成亲脂性和高亮度的产物(50b, 51b)来标记动脉粥样硬化斑块中的LD。由于ONOO−inAS和非AS的表达水平有显著差异，因此AS LD的荧光信号远高于非AS LD。他们还显示出在小鼠模型中清晰可视化AS形成的能力，表明其具有很高的临床应用潜力。
癌症中的LD探针
癌细胞通过增加细胞内从头开始的脂质合成和外部脂质摄取来维持异常活跃的脂质代谢。许多研究表明，LD在不同类型的癌症中都有异常积累。这意味着癌细胞中改变的LD可以作为癌变的生物标志物。目前，LD正成为一个非常有吸引力的肿瘤诊断靶点。因此，应用于肿瘤环境的LD靶向探针也在不断发展。早前，Yang等人利用52号探针(DNS-M)发现正常细胞和癌细胞中LD的形态和数量存在显著差异，证实了LD作为癌症生物标志物的潜力。随后，He等人报道了一种基于酮花碱策略的近红外发射探针53，该探针能够对极性动态进行超灵敏的荧光响应。利用53，研究人员进一步确定了HCC细胞<其他癌细胞<正常细胞的极性序列。本研究为HCC与其他类型细胞的鉴别及肝细胞癌的准确诊断提供了有效的工具。最近，Polita等人利用黏度敏感的BODIPY探针54 (BODIPY- LD)发现癌变的A549和非癌变的HEK293T细胞中LD的微黏度存在显著差异。因此，LD的黏度也可以作为癌症诊断的生物标志物。Li和Yan小组应用了双靶标策略，利用探针或生成产物的亲脂性和与癌症相关的生物标志物，设计了探针55a (BTDA-RSS)和56a (NATPA)。在对抗肿瘤微环境中丰富的生物硫醇或H2O2(反应后产物分别为55b和56b)后，55a和56a能有效分化癌细胞和正常细胞。
铁死亡过程中的LD动力学
Ferroptosis是2012年发现的一种独特的细胞死亡方式，其特征是铁依赖性脂质氧化。铁死亡需要许多来自不同细胞器的脂质合成和过氧化调节剂，包括细胞核、溶酶体、ER、线粒体、高尔基体、过氧化物酶体和脂滴。作为脂质储存和交换的枢纽，LD与铁死亡高度相关。大量研究已经证明，增加LD的形成可以保护细胞免受ER应激和脂肪毒性的影响。最近的证据表明，铁死亡的早期阶段LD数量增加，但在晚期阶段减少。形成和降解之间的平衡影响LD在铁死亡中的作用。rab7a介导的脂质吞噬会增强肝癌细胞的铁死亡。肿瘤蛋白D52 (TPD52)介导的脂质储存则会抑制铁死亡。
芬顿化学反应和脂质过氧化所发生的在铁死亡期间可能导致LD粘度和极性的变化。为了探索铁死亡过程中黏度的变化，Lin等人设计了一种黏度敏感的LDs特异性探针57 (BDHT)。该探针由三个交替的单键和双键连接。在粘性环境下，单键的旋转会被阻止，激发后产生强烈的荧光。已经证明，甘油中57的荧光强度比水中高23倍。并且发射强度与甘油的比例之间存在良好的线性关系，表明具有良好的粘响应性能。在erastin-或rsl3处理的癌细胞诱导铁死亡过程中，观察探针标记的LD的荧光强度，揭示了铁死亡过程中LD粘度的显著增加。为了进一步研究与LD相关的铁死亡过程，Wei等人使用粘度敏感的LD特异性荧光探针58 (WD-1)来跟踪斑马鱼和HeLa细胞在铁死亡过程中的粘度动态。该探针由1,3-茚二酮偶联二甲亚胺萘(作为转子)组成。进一步引入十甲基胺可以增强对LD的结合亲和力。与58，他们研究了紫杉醇对癌细胞铁死亡过程的影响。他们的研究结果表明，紫杉醇可能影响铁死亡的发生，为更深入地了解铁死亡反应提供了强有力的化学工具。在另一项研究中，Yu等人创新设计了TICT-AIE集成探头59 (TPE-V1)，采用双发射模型，也可用于实时监测铁死亡期间LD粘度变化。在另一项研究中，Wang等人报道了LD/细胞核双靶比测量荧光探针，即60 (CQPP)。该探针由高脂溶性香豆素和可与DNA结合的细胞核染料Hoechst 33,342组成。由于其供体-受体结构，探针的荧光发射也受到极性的影响，主要是在波长和量子产率方面。通过使用60，观察到铁死亡期间LD极性明显增加。此外，探针60可以作为一种有用的化学工具，根据荧光成像的细胞核形态变化来区分铁死亡和细胞凋亡。在最近的一项研究中，Liu等人基于四环融合epindolidione开发了一种LDs特异性探针61 (Lipi-EP)用于铁死亡研究。由于大π共轭平面结构，61表现出出色的光稳定性和较长的荧光寿命。通过使用61进行延时成像，观察到铁死亡过程中2-3小时内LD的耗尽。2024年，wang等人设计合理，研制出AIE LD探针62 (TPABTBP，)，用于监测心肌缺血小鼠铁死亡过程中LD的动态变化。他们发现心肌细胞中的LD积累在铁死亡的早期阶段增加，但在脂质吞噬的后期阶段减少。此外，他们还发现，抑制LD分解代谢可显著降低心肌细胞中的脂质过氧化水平。这可能是心肌缺血/再灌注损伤疾病干预的潜在治疗靶点。这些研究共同表明，LD动力学(包括粘度、极性、形成和降解平衡等)与铁死亡有关。
LD靶向光动力光敏剂
光动力疗法(photodynamictherapy, PDT)是一种微创的癌症治疗方法，但对健康组织的毒性较低，其中光敏剂(PS)在特定波长照射激发后产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)。通常情况下，PS本身是无毒的(不与生物分子发生反应)。然而，当来自光激发的PS的能量转移到O2时，产生的ROS，特别是超氧化物和单线态氧(1O2)，可引起直接的细胞损伤(如凋亡和坏死)，激活免疫反应(如细胞因子释放和白细胞活化)，以及间接的血管关闭(如微血管塌陷和血管收缩)。这些级联的生化反应最终诱导肿瘤的破坏。根据产生的ROS类型，PS可分为两类。I型PS产生超氧阴离子(O−2•)、羟基自由基(•OH)、过氧化物(H2O2、ROOH)和氢过氧化物自由基(HOO•)。II型PS产生10o2。通常，两种类型的光化学反应可以同时发生。这些ROS的比例取决于PS的光物理和光化学性质、工作浓度和细胞氧。对于在细胞模型中进行的光动力反应，同样重要的是要注意一些产生的ROS的生命周期非常短。例如，1O2在细胞中的半衰期和扩散距离分别约为0.01-0.04 μs和0.01-0.02 μs。有限的寿命和作用范围直接决定了PS的工作区域非常狭窄，这一特点通常有助于对靶细胞对正常细胞的选择性。当使用细胞器靶向光敏剂时，由于光敏剂新生成的ROS(特别是1O2))很少离开细胞，因此可以进一步提高治疗效果。LD被认为是理想的靶细胞器之一，因为1)荧光光敏剂可以实现荧光成像引导的PDT, 2) LD的尺寸在20 nm-100 μm之间，其面积可以进一步限制细胞内PS和ROS的工作区域。3) LD内丰富的脂质和LD靶向PS产生的ROS可以为脂质过氧化提供充足的材料和良好的平台，PDT与铁死亡之间可能存在协同效应。一些研究表明，LD在癌细胞中异常积累，LD的破坏对细胞的繁殖和生长是致命的。因此，LD靶向光敏剂可以作为有效的PDT试剂用于癌症治疗。传统的光敏剂如卟啉和酞菁在高浓度下经常面临聚集引起猝灭(ACQ)的问题。而AIE发光团可以克服这一限制，并已广泛应用于开发新型光敏剂。在最近的一项研究中，Tan等人开发了一种LDs靶向生物杂芳基桥接光敏剂63 (TIFMN)，具有基于三苯胺的AIE特性。63可以特异性定位于活细胞和人透明细胞肾细胞癌(ccRCC)肿瘤组织中的LD。重要的是，63能够在3 μm浓度下通过ros诱导的DNA损伤和凋亡，基于PDT效应有效地杀死肿瘤细胞。后来，包括64/65 (BDBDC/TDTI)在内的几种PDT探针分别具有优异的固态荧光量子产率和强大的ROS生成能力，被开发用于抗肿瘤治疗。具有刺激激活的锁定策略有助于提高癌细胞光敏剂对正常细胞的选择性。为此，Li等人利用肿瘤组织中过表达的过氧化氢(H2O2)作为刺激物，构建了一种基于二酮吡咯骨架的光敏剂，称为DPP-BPYS (66a)。经过一系列氧化解离和1,6消除反应，得到66a的活化产物，称为DPP-BPY (66b)。DPP-BPY具有AIE特性，具有近红外发射特性、LD靶向特性以及生成ROS诱导细胞凋亡的良好能力的肿瘤细胞。上睑死亡正成为癌症治疗中一个很有前景的靶点。LD内丰富的脂质允许LD靶向光敏剂照射后发生铁死亡。最近，Silva等人合成了一组硼酸衍生的水杨酸乙腙(BASHY)染料，发现67是一种高效的单重态氧光敏剂。67具有LD靶向特性，对人多形性胶质母细胞瘤(GBM) U87癌细胞具有明显的光毒性，IC50值为4.4 nm。重要的是，研究人员证明了LD定位在增强光毒性作用和诱导铁死亡方面的重要作用。采用相同的策略，Xiong等人设计了一种LD靶向的I型光敏剂MNBS(68)，用于在缺氧和常氧条件下对4T1细胞进行铁致死介导的PDT, IC50值分别为32 nm和28 nm。这些工作证明了LD靶向光敏剂是促进pdt诱导的癌细胞铁死亡的有效工具。
LD靶向降降剂
增强目标降解是一种很有前途的疾病治疗新方法。各种疾病中LD的异常积累提出了LD降解是否可以用于疾病治疗的问题。微自噬(以下简称自噬)存在于所有真核细胞中，可将货物(如蛋白质或细胞器)吞噬到自噬体中，用于随后的溶酶体降解。其中，细胞内脂滴的自噬降解，也称为脂噬，是维持生理系统功能的关键。这表明利用特定的自噬标记物来降解LD是可能的。为此，Lu小组提出了一种新的降解策略，称为自噬系固化合物，其中化合物与目标目标和关键自噬体标记蛋白LC3相互作用，可以增强货物的自噬降解。研究人员成功鉴定了四种连接化合物，它们与突变型亨廷顿蛋白(mHTT)和LC3相互作用。这些化合物有利于降低mHTT水平和挽救疾病相关表型。他们进一步探索了attec降解LD细胞器的潜力。通过疏水连接剂将上述鉴定的LC3配体(69 (GW)或72 (DP))与LDs靶向染料(苏丹IV或苏丹III)连接，设计LD降解剂(LD•attec)，生成4个候选LD降解剂(73，(LD⋅ATTEC1)， 74， (LD⋅ATTEC2)， 75， (LD⋅ATTEC3)， 76， (LD⋅ATTEC4))。选择69和72作为LC3配体，而不是70和71，因为69/72不影响自噬活性，这对正常生理状态具有重要意义。当69或72的片段与LC3结合时，73-76的LD降解物将被锚定在自噬体上。进一步形成三元络合物(LD降解体、自噬体和LD)将促进LD。研究人员在动物模型中验证了探针73/74/75/76的降解是通过LC3和自噬降解介导的，并且75/76可以有效降解LD并挽救LDs相关表型。
展望
LD的动态(数量、大小、形成、降解以及脂质组学和蛋白质组学的组成)与细胞功能密切相关。目前用于LD的生化工具和相关发现引发了对LD领域兴趣的爆炸性增长。然而，LD动力学的生物学本质仍然是难以捉摸的。因此，性能优异的小分子探针成为时尚。通过使用LD靶向探针和荧光成像，可以很容易地检测LD与其他细胞区室之间的接触。然而，所使用探针的脱靶引起的一些假阳性信号令人非常关注，需要开发对LD接触位点和光学性质具有优异选择性的化学探针。此外，关于哪些蛋白质参与其中以及LD与细胞其余部分之间的通信的接触位点是什么，人们的理解仍然有限。随着蛋白质组学技术的进步，我们相信基于活性探针的化学蛋白质组学将在阐明动态串扰的分子机制方面显示出巨大的潜力。还应注意的是，当接触位点暴露于细菌、病毒和寄生虫引起的代谢改变和/或致病性感染时，往往会发生LD接触位点的重排。超分辨率成像与蛋白质组学的结合可能是表征重塑原理的有效方法。最后，澄清动态串扰如何影响疾病的发生和进展具有重要意义，这将有助于开发基于小分子的检测试剂盒和有效的抑制剂，从而走向新的诊断和治疗途径。
超分辨率显微镜(SRM)的技术发展仍然有很大的需求，SRM在LD中的潜力尚未得到充分体现。蛋白质主要通过CYTOLD和ERTOLD通路定位到LD。是否存在LD蛋白靶向的其他途径仍有待研究。超分辨率技术、硅方法(如分子动力学模拟和蛋白质结构预测算法)和分子生物学方法的结合可以为LD靶向氨基酸序列的鉴定提供更精细的视角。先前的研究表明，一些LD蛋白在生物发生的非常早期就靶向LD，而其他蛋白质则在更晚的时候定位到LD，这表明了不同的及时方式。由于具有时空分辨率的优势，超分辨率成像还可以用于阐明蛋白质靶向LD的时间，并描述相应的生命周期后果，包括TAG合成，LD出芽，生长，周转率或与其他细胞器的相互作用。
有趣的是，关于LD蛋白质组并没有达成共识。鉴于LD蛋白对LD功能至关重要，LD领域的另一个重大下一步将是准确定义活细胞中LD蛋白质组的组成。目前对LD蛋白的分析主要依赖于LD分离与LC-MS/MS分析相结合。然而，这种方法经常面临污染的问题，导致一些假阳性。此外，它不能反映LD蛋白的时空信息。最近，一种APEX靶向ATGL和PLIN2的近端策略被开发出来。通过使用这种方法，从U2OS和Huh7细胞中鉴定了100多个高置信度的LD蛋白。然而，由于细胞质蛋白有许多非特异性标记，因此需要分离LD。在没有LD分离的情况下对活细胞中的LD蛋白进行原位分析仍然具有挑战性，对于理解LD的行为和功能是非常有价值的。基于活性探针的化学蛋白质组学可能是LD蛋白质组学研究的新途径。在此，一个基本的先决条件是找到合适的探针，使其能够以最小的非特异性结合近端交联LD蛋白。这种化学工具将对不同细胞类型和各种疾病环境中的LD蛋白质组的定位非常有用，从而提供许多重要的细胞生物学见解。
参考文献
Trends in small-molecule probes for lipid droplets , Yaochen Tu , Wenjie Zhang , Jiaqian Yan , Miaomiao Wang , Bubin Xu * , Yusheng Xie ,Trends in Analytical Chemistry, 2025, 190, 118287，https://doi.org/10.1016/j.trac.2025.118287
