内容提要
本研究提出了一种有效的“加速电荷分离态形成”的策略，以同时提高NIR-II发射，以及NIR可激发光疗试剂的I型和II型光敏化效率。在近红外808 nm激发下，6TP-IH的荧光、·OH和1O2产生效率a分别提高到8TP-IF的15.6倍、2.21倍和3.38倍。将6TP-IH包埋在纳米粒子(NPs)中，使其在NIR-II荧光图像引导的肿瘤联合治疗中得到应用。体外和体内研究证实，6TP-IH纳米粒具有精确的肿瘤成像能力，通过协同光动力和光热治疗，具有强大的肿瘤消融和有效激活肿瘤免疫原细胞死亡(ICD)的能力。在4T1荷瘤小鼠模型中，这些效应共同产生了令人印象深刻的99.1%的肿瘤抑制率。
实验结果与讨论
本研究选择了这类光疗剂作为研究模型分子。随后设计并合成了6种光疗剂，即8TP-IH、8TP-IS、8TP-IF、6TPIH、6TP-IS和6TP-IF，它们的融合环和吲哚受体数目不同。利用DSPE-PEG2000作为聚合物基质，将这些疏水分子进一步包覆到纳米粒子中，使其具有良好的亲水性。通过动态光散射(DLS)分析证实，在透射电子显微镜(TEM)下观察到的纳米粒子具有均匀的球形，流体动力学直径始终保持在约100 nm左右。我们重点研究了8TP-IH、8TP-IS和8TP-IF，它们具有相同的融合环核心，但具有不同的吲哚类型受体。在水溶液中，8TP-IF纳米颗粒在740 nm处有一个吸收峰，在810 nm处有一个肩峰，8TP-IS纳米颗粒的吸收峰蓝移到713和795 nm，8TP-IH纳米颗粒的吸收峰蓝移到703和775 nm。所有的NPs都显示出与临床使用的808 nm激光的兼容性。8TP-IF、8TP-IS和8TP-IH纳米粒子的发射峰分别位于936、911和887 nm，与它们的吸收峰一致。值得注意的是，所有三种NPs的荧光都延伸到了第二近红外(NIR-II)区域，8TP-IH NPs的强度比8TP-IF NPs显著增强了8.8倍。测定了三种分子在1000-1300 nm波长范围内的绝对荧光量子产率。8TP IH和8TP IS纳米粒子的量子产率分别为0.71%和0.61%。·OH和1O2分别是最有效的I型和II型ROS，因此是我们研究其光敏性质的主要焦点。X-射线光电子能谱测得8TP-IH、8TP-IS和8TP-IF的光氧化电位分别为2.01V、2.05V和2.08V，均高于EOH−/·OH(1.99V vs.NHE，pH=7)，表明它们具有光氧化H2O2为·OH的潜力。分别以羟基苯基荧光素(HPF)和9，10-二苯基二(亚甲基)二丙二酸(ABDA)为·OH和1O2指示剂，评价了8TP-IH、8TP-IS和8TPIF纳米粒的ROS生成效率。根据HPF增强的荧光强度，8TP-IS的·OH产生效率是8TP-IF的1.58倍，8TPIH的·OH产生效率进一步提高到8TP-IF的2.05倍。ABDA的分解速率表明，8TP-IS和8TP-IF纳米粒的产氧率相当，而8TP-IH的产氧率是8TP-IF的1.50倍。应该强调的是，这三种纳米粒子的光诱导效果都比吸收和发射峰值相近的著名光疗剂吲哚青绿(ICG)好得多，8TP-IH纳米粒子产生·OH和1O2的效率分别是ICG的2.16倍和18.71倍。理论模拟结果表明，三种光疗剂都表现出非常相似的优化结构，HOMO和LUMO的分布，以及S和T态之间的能隙，这表明ISC过程不应该是导致这些分子之间荧光强度和光敏效率差异的主要因素。
大的平面共轭芳香族体系通常会导致π-π堆积，从而降低荧光强度和光敏化效率。因此，我们将8TP-IH、8TP-IS和8TP-IF中的融合环数量从8个减少到6TP-IH、6TP-IS和6TP-IF中的6个，以减少π-π堆积，并进而增强光疗性能。预置了6TP-IH、6TP-IS和6TP-IF的性质。6TP-IH纳米粒子在水中的两个吸收峰分别为703和773 nm，与8TP-IH纳米粒子的吸收峰非常相似。然而，这两个峰在水溶液中的强度比发生了显著的变化，这可能表明聚集行为发生了变化。6TP-IH纳米粒子的发射强度增强到8TP-IH纳米粒子的1.77倍，在NIRII区域的绝对荧光量子产率为1.37%。此外，与8TP-IH NPs相比，·OH和1O2的产生效率分别提高到1.08倍和2.26倍，分别是ICG对照组的2.32倍和41.09倍。
从8TP-IF和8TP-IS到6TP-IF和6TP-IS也分别观察到相同的现象。与最初的8TP-IF相比，通过受体工程和聚集结构优化的级联方法，6TP-IH从LE状态到CS状态的转变加速了近一个数量级，导致荧光强度、·OH和1O2产生效率分别提高了15.6倍、2.21倍和3.38倍。根据Jablonski图，荧光强度和光敏化的增强预计会导致光热效应的相应减少。因此，还评估了这些光疗剂NPs的光热效应。所有六个纳米粒子都表现出比ICG更好的光热效应。在相同条件下，6TP-IH纳米粒子的温升仅比其他纳米粒子低2-3℃，并且表现出高达40.7%的光热转换效率。事实上，温度升高的有限减少很难对PTT疗效产生实质性影响。此外，用6TP-IH纳米粒子作为光热剂，在加热-冷却过程的四个循环中，温升几乎相同，并且与功率密度和浓度呈线性正相关，表明6TP-IH纳米粒子具有优异的光稳定性。结合808 nm近红外激光激发、更优越的近红外-II发射以及I型和II型光敏化的特点，6TP-IH纳米粒子在图像导引光疗方面显示出巨大的潜力。
采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定ICG、8TP-IF和6TP-IH纳米粒的细胞毒性。在黑暗条件下，6TP-IH纳米粒、8TP-IF纳米粒和ICG即使在80微克毫升−1的高浓度下也几乎不能影响4T1细胞的活力，表明暗毒性较低。相反，6TP-IH纳米粒在808 nm激光照射下表现出剂量依赖性的细胞毒性，半数抑制浓度(IC_(50))为12.6，远低于两个对照组(8TP-IF纳米粒为20.0，ICG为99.5。此外，6TP-IH纳米粒在有或没有抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情况下表现出不同的光诱导癌细胞消融作用，表明6TP-IH纳米粒的光毒性来自于PDT和PTT的协同作用。同时进行钙黄素-AM/碘化丙啶(PI)染色。分别代表活细胞和死亡细胞的不同组的绿/红荧光比值表明，与8TP-IF纳米粒和ICG相比，6TP-IH纳米粒具有更好的光诱导抗肿瘤作用。PDT具有诱导ICD的潜力，从而获得更好的抗肿瘤治疗效果。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放、钙网蛋白(CRT)的暴露和三磷酸腺苷(ATP)的分泌已被认为是ICD的特征。通过共聚焦成像，可以清楚地看到，在808 nm激光照射下，6TP-IH纳米粒子将导致HMGB1从细胞核释放，CRT暴露在细胞膜上。此外，在6TP-IH纳米粒子和激光照射下，4T1细胞中的ATP浓度将显著增加6倍以上。这些结果表明，抗癌治疗的“Eat-Me”信号被成功激活。
建立了荷瘤小鼠模型，以8TP-IF纳米粒和ICG为参照物，评价了6TP-IH纳米粒的体内光疗效果。尾静脉注射6TP-IH纳米粒2 h后，可在肿瘤区域观察到−-II荧光，并在24 h内随时间增强而增强，表明6TP-IH纳米粒通过增强通透性和滞留作用积聚肿瘤。通过传统的NIR-I荧光成像，也观察到类似的现象，6TP-IH纳米粒子注射24 h后，肿瘤部位的荧光强度最强，因此选择静脉注射6TP-IH纳米粒子24 h后作为接受808 nm激光治疗的时间点。从活体成像结果来看，8TP-IF NPs和ICG也可以在肿瘤部位蓄积，最佳蓄积时间分别为注射后12h和10min。静脉注射48h后，取各组小鼠主要脏器和肿瘤组织，定量分析光疗剂在体内的生物分布。实验结果表明，8TP-IF和6TP-IH纳米粒在肝、脾和肿瘤组织中显著蓄积，而ICG在48小时内几乎完全代谢。
在最佳浓缩时间点，6TP-IH纳米粒子在接受808 nm激光照射4min后，肿瘤部位的温度因光热效应而升高到45℃。作为对照，8TP-IF纳米粒子仅能实现42℃的温度升高，而ICG在相同条件下几乎不会导致温度升高。因此，6TP-IH纳米粒子实现的较高温度可能是由于肿瘤部位较好的积聚所致，这是意想不到的，但实现了有利于进一步提高光疗效果的原因。在14天的随访期内，进一步评估了这些光疗剂的体内光疗效果。在根据肿瘤的最佳聚集时间静脉注射合适的时间后，肿瘤部位只接受激光照射5min。在整个治疗过程中每隔两天记录一次小鼠的肿瘤体积和体重。与其他实验组相比，6TP-IH纳米粒+L组对肿瘤生长具有明显的抑制作用，肿瘤抑制率高达99.1%。为了便于比较，我们还增加了另一组，将6TPIH纳米粒的光疗时间点从24小时改为12小时，这实际上是8TP-IF纳米粒最合适的时间点。6TP-IH纳米粒的抑瘤率高达96.0%，而8TP-IF纳米粒的抑瘤率仅为16.8%。此外，所有小鼠的体重在14天的治疗期内保持稳定增长，表明这些光疗剂的生物毒性最小。
结论
通过受体工程和聚集体结构优化的级联方法加速LE到CS状态的转变，开发了近红外激光可激发多功能光热敏剂6TP-IH。与原来的对照分子8TP-IF相比，其荧光强度、·OH和1O2产生效率分别提高了15.6倍、2.21倍和3.38倍。此外，6TP-IH还表现出高达40.7%的光热转换效率。因此，在体内近红外-II荧光图像引导的肿瘤光动力疗法和光动力疗法的联合治疗中，6TP-IH在仅接受5min808 nm激光(330 mW cm−2)照射的情况下，显示出很高的抑瘤率99.1%。通过对激发态光物理过程的深入研究，阐明了电荷分离态形成速率在近红外激光可激发光疗剂中的重要性，为高性能近红外光疗剂的开发提供了新的机遇。
参考文献
Simultaneously Enhancing NIR-II Emission, Type-I, and Type-II Photosensitization Through Acceleration of Charge-Separated-State Formation for Tumor Phototheranostics. Yaru Lu, Yuchen Song, Yajing Jiang, Min Li, Zhengyumeng Zhu, Jucai Gao, Leilei Shi,Yu Tian, Dugang Chen, Duo Mao, Fang Hu, and Wenbo Wu. Angew. Chem. Int. Ed. 2025, e21182，https://doi.org/10.1002/anie.202521182
