内容提要
本文报道一种不依赖氧气的光催化剂（EBSe）通过近红外（NIR）光诱导的铁死亡/焦亡/胀亡协同作用来增强肿瘤免疫治疗效果。通过对亚甲基蓝（MB）进行简单的硒（Se）和乙基修饰，赋予了 EBSe 显著的光毒性增强效果（>2500 倍），并且在缺氧条件下对 4T1 细胞具有优异的光毒性指数（PI > 32,000）。EBSe 表现出自适应的光动力过程，在常氧条件下可生成增强的I型/ II 型活性氧（ROS），在缺氧条件下则提高碳自由基的产生。EBSe 显示出更高的细胞摄取率，并经历光诱导的溶酶体至细胞核的转位，从而激活铁死亡、焦亡和胀亡。这三种非凋亡途径的协同作用增强了 4T1 荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应。
MB 衍生物的设计与合成
基于吩噻嗪的光敏剂亚甲基蓝（MB）已通过 FDA 批准并在临床上广泛应用，其具有出色的生物安全性、光稳定性和近红外激发 / 发射特性。为了保持生物安全性并便于未来的临床转化，仅允许对 MB 骨架进行有限的结构修饰以优化其光动力性能。首先，为了获得更高的三线态布居和 ROS 生成能力，我们采用单原子取代策略，用 Se 替代 S 以提高系间窜越（ISC）速率。其次，引入乙基取代甲基以改善增色效应并增强亲脂性，从而提高光吸收能力和细胞摄取效率。设计并合成了四种化合物，即 MB、EB、MBSe 和 EBSe。
体外光谱与光敏特性
在不同溶剂中对四种光敏剂（MB、EB、MBSe 和 EBSe）的吸收 / 发射光谱及光物理 / 光化学性质进行了表征。在甲醇中，与 MB（λₑₓ=652 nm，λₑₘ=680 nm）相比，EBSe 的吸收和发射光谱均出现轻微红移（λₑₓ=662 nm，λₑₘ=694 nm）。此外，EB（ε=1.144×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）和 EBSe（ε=1.337×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）的摩尔消光系数显著高于 MB（ε=0.864×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）和 MBSe（ε=0.751×10⁵ M⁻¹ cm⁻¹）。在含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI-1640 生物培养基中，MB、MBSe、EB 和 EBSe（10 μM）的吸收光谱在 48 小时后几乎无变化，表明这些试剂具有优异的化学稳定性。在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，四种光敏剂经光照（150 mW/cm²）后均表现出高光稳定性，吸收光谱变化可忽略。此外，EBSe 的吸收光谱在生理 pH 范围（4.0-9.0）内基本保持不变，表明其作为近红外光敏剂在生物系统中具有实际应用潜力。EB 和 EBSe 的 logP 值显著高于对应的甲基取代衍生物 MB 和 MBSe，这与 EB 和 EBSe 在 PBS 溶剂中比 MB 和 MBSe 形成更高程度的 H - 二聚体的现象一致。上述结果归因于二乙胺基团相比二甲胺基团具有更强的给电子能力和亲脂性。MBSe（0.6%）和 EBSe（0.5%）的荧光量子产率（Φբ）显著低于 MB（23%）和 EB（18%），而它们的单线态氧量子产率（ΦΔ，85% 和 81%）则显著高于 MB（52%）和 EB（57%）。这些结果主要归因于重原子 Se 的引入，其增强了系间窜越并淬灭了荧光。使用二氢罗丹明 123（DHR123）和羟基苯基荧光素（HPF）作为指示剂，在 PBS（pH 7.4）中评估了四种光敏剂的 I 型 ROS 生成能力，以检测 O₂⁻・和・OH。结果显示，EBSe 在 O₂⁻・和・OH 生成方面表现最佳。随后，通过电子自旋共振（ESR）测量进一步证实了光诱导的 ROS 产生。2,2,6,6 - 四甲基哌啶（TMP）用作单线态氧捕获剂，5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO）用作 O₂⁻・和・OH 的自旋捕获剂。在常氧条件（21% O₂）下用 660 nm 激光照射时，EBSe 和 MBSe 的 ¹O₂ ESR 信号高于 EB 和 MB。在常氧条件下的甲醇中，EBSe 的 O₂⁻・生成信号最高，而 MBSe 的表现最差，这与荧光指示剂测试结果一致。同时，在常氧条件下的含水电解质中，EBSe 的・OH 的 EPR 信号最高，并伴随碳中心自由基的 EPR 信号。在缺氧条件下（<1% O₂，手套箱中），碳自由基特征信号占主导，且 EBSe 诱导的信号最强。有趣的是，EBSe 在缺氧条件下产生的碳自由基信号相对稳定，在黑暗中重新暴露于氧气后可逐渐转化为 O₂⁻・和・OH。使用 HPF 和 DHR123 作为指示剂的荧光分析中也观察到类似结果。
EBSe 在肿瘤细胞中的光动力性能
首先，通过甲基噻唑基四唑（MTT）法研究了四种光敏剂对 4T1 细胞的暗毒性和光毒性。所有四种光敏剂均表现出极低的暗毒性（IC₅₀>512 μM），表明对 MB 的细微修饰仍保持了优异的生物安全性。在光照条件下（660 nm，100 mW/cm²，5 min），MB 在常氧下表现出中等毒性（IC₅₀=9.2 μM），而在缺氧条件下毒性显著减弱（IC₅₀=40.2 μM）。EB 在常氧（IC₅₀=3.4 μM）和缺氧（IC₅₀=10.8 μM）条件下的光毒性均略有改善，而 MBSe 在常氧下光毒性增强（IC₅₀=4.0 μM），但在缺氧下毒性降低（IC₅₀=60.6 μM）。值得注意的是，EBSe 在常氧（IC₅₀=0.014 μM）和缺氧（IC₅₀=0.016 μM）条件下均表现出极强的光毒性。与 MB 相比，EBSe 在缺氧条件下对 4T1 细胞的光毒性提高了 2500 倍以上，且几乎不依赖氧气，具有出色的光毒性指数（PI，暗毒性与光毒性之比），常氧下 > 36,000，缺氧下 > 32,000。在另一种难治性胰腺肿瘤细胞系 PAN02 中，EBSe 在缺氧条件下的光毒性（IC₅₀=0.018 μM）比 MB（IC₅₀=71.4 μM）提高了近 4000 倍，且氧气依赖性最低。此外，在正常细胞（BNL CL.2 细胞和 HK-2 细胞）和癌细胞（HeLa 细胞和 MDA-MB-231 细胞）中，EBSe 在缺氧条件下的 IC₅₀值相似，PI 值为 24,000-34,000，而 MB 的 PI 值为 12.5-13.6。作为光动力疗法的金标准，Photofrin 在常氧下表现出中等光毒性（IC₅₀=2.2 μM），在缺氧下光毒性显著减弱（IC₅₀>16.0 μM），且具有可测量的暗细胞毒性（IC₅₀=86.5 μM）。Photofrin 对 4T1 细胞的光毒性从常氧到缺氧明显下降（效率降低 7.3 倍以上），而 EBSe 几乎不依赖氧气，且在缺氧下的光毒性高出 1000 倍以上。结果表明，单一的 Se 或乙基修饰仅能有限地增强光动力性能，而两种修饰的协同作用显著提高了光动力性能。
为了研究光动力性能显著改善的详细机制，我们随后评估了光敏剂的细胞摄取及其在 4T1 细胞中诱导的细胞损伤。正如预期的那样，由于其更高的 logP 值，乙基取代的 PS EB 和 EBSe 的细胞摄取量明显高于其甲基取代的对应物。通过添加不同的抑制剂或在不同温度下孵育，进一步研究了 EBSe 的细胞摄取机制。结果表明，添加尼日利亚菌素（溶酶体质子梯度抑制剂）后，EBSe 的细胞摄取量减少了 27%，在 4°C 下孵育后减少了 45%，表明 EBSe 依赖质子泵和胞饮作用进入细胞。随后，使用二氢乙锭（DHE）和 2,7 - 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为荧光指示剂，分别评估了 4T1 细胞内的 O₂⁻・和总 ROS / 碳自由基的产生。在光照（660 nm，15 mW/cm²，5 min）下，EBSe（0.1 μM）在常氧和缺氧条件下均触发了明显的 O₂⁻・和总 ROS / 碳自由基信号，荧光明亮，而 MB（0.1 μM）在相同条件下几乎没有诱导信号。使用钙黄绿素 AM 和碘化丙啶（PI）作为指示剂进行活 / 死细胞共染色实验。EBSe（0.015 μM）在光照（660 nm，100 mW/cm²，5 min）下以不依赖氧气的方式有效杀死 4T1 细胞，而 MB（10.0 μM）在缺氧条件下的肿瘤杀伤效率显著降低。
我们通过共聚焦荧光成像研究了 EBSe 的亚细胞分布。光照前，EBSe 染色的 4T1 细胞的荧光图像与 LysoTracker 染色的细胞重叠良好（皮尔逊相关系数，PCC=0.85），表明 EBSe 在细胞摄取后主要分布在溶酶体中。有趣的是，光照（100 mW/cm²，5 min）后，EBSe 与 LysoTracker 染色的细胞重叠明显减少（PCC=0.20），同时 EBSe 与 Hoechst 33342 染色的细胞重叠显著增加（PCC=0.72）。结果表明，EBSe 在光照下可导致溶酶体严重损伤，并转移至细胞核直接损伤核酸。类似地，MBSe、MB 和 EB 的红色荧光信号在光照 10 分钟后也从溶酶体迁移至细胞核。通过吸收和发射滴定实验证实了 EBSe 对 DNA 的亲和力高于 RNA。光照（100 mW/cm²，5 min）后，EBSe（0.015 μM）诱导的 γ-H2AX 表达水平显著高于 MB（4 μM），表明 EBSe 的 DNA 损伤能力显著更强。使用线性化 DNA 片段通过琼脂糖凝胶电泳分析评估了 EBSe 的光诱导 DNA 损伤能力，结果证实 EBSe 可以在不依赖氧气的情况下直接有效地损伤 DNA。综上所述，EBSe 在近红外光照射下可对溶酶体和细胞核造成级联损伤。
EBSe 在光动力治疗中诱导铁死亡、焦亡和胀亡
我们随后进一步探究了 EBSe 从溶酶体到细胞核的光诱导转位效应，并以 MB 作为对照。用吖啶橙（AO）和 MB（8 μM）孵育的 4T1 细胞在光照（660 nm，100 mW/cm²，5 min）前后均未显示 AO 的橙红色荧光信号变化，表明溶酶体完整性未受破坏。然而，经 AO 和 EBSe（0.1 μM）染色的 4T1 细胞在相同光照条件下，橙红色荧光消失，表明 EBSe 在更低浓度下即可诱导明显的溶酶体膜通透性增加（LMP）。同时，当用 EBSe 孵育的细胞（0.02 μM）接受 660 nm 光照（100 mW/cm²，5 min）时，BCECF-AM（pH 指示剂）的绿色荧光消失，FerroOrange（Fe²⁺传感器）的橙色荧光增强，表明光照诱导的 LMP 导致 H⁺和 Fe²⁺水平升高。EBSe 光照后诱导的细胞内 Fe²⁺和 ROS 升高可能导致铁死亡通路激活。无论在常氧还是缺氧条件下，C11-BODIPY 染色的 4T1 细胞经 EBSe + 光照处理后，红色荧光减弱，绿色荧光增强，而 MB + 光照处理组未出现此现象，表明 EBSe 在光动力治疗中可引起脂质过氧化物（LPO）积累。Western blot 分析显示，EBSe（0.015 μM）处理的 4T1 细胞在光照后，谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4，一种关键的铁死亡抑制蛋白）和 GSH 水平（细胞内抗氧化剂）下调。此外，铁死亡抑制剂 Ferrostatin-1（Fer-1）预处理可显著挽救常氧条件下经 EBSe 和光照处理的肿瘤细胞，在缺氧条件下也观察到类似结果。上述结果证实，EBSe 在近红外光动力治疗中可诱导 4T1 细胞发生明显的铁死亡。除 Fer-1 外，焦亡抑制剂四乙基秋兰姆二硫化物（TETD）也部分提高了 EBSe 和光照处理的 4T1 细胞存活率，表明光动力治疗过程中可能激活了焦亡。此外，光照后，EBSe 处理的细胞在细胞膜周围观察到多个气泡状突起，这是焦亡的典型形态特征。焦亡被认为是由 Gasdermin（GSDM）蛋白家族介导的炎症性程序性细胞死亡（PCD）。Western blot 检测显示，EBSe 处理的细胞（0.015 μM）在光照下，前 caspase-1 和 GSDMD 表达下调，同时 GSDMD 的 N 端片段（GSDMD-N）表达上调。此外，在 EBSe 和光照处理的细胞上清液中检测到细胞因子白细胞介素 - 1β（IL-1β）和白细胞介素 - 18（IL-18）水平升高。同时，在 EBSe 和光照处理的细胞上清液中也观察到 ATP 和乳酸脱氢酶（LDH）的大量释放。然而，用更高浓度 MB（8 μM）处理的细胞在光照后未显示焦亡激活迹象。结果表明，EBSe 处理的 4T1 细胞在光照下可激活明显的 GSDMD 介导的焦亡，导致炎症细胞因子大量释放。
EBSe 的体内光诱导肿瘤免疫治疗
受 EBSe 在体外令人印象深刻的光动力性能启发，我们进一步在 4T1 荷瘤小鼠中评估了其抗肿瘤光疗活性和协同免疫治疗效果。首先，在瘤内注射 MB 和 EBSe（50 μM）后，使用体内成像系统（IVIS）进行荧光成像。EBSe 处理的肿瘤区域平均荧光强度在注射后 30 分钟达到最大值，且在注射后 24 小时仍可清晰观察到。当肿瘤体积达到 40 mm³ 时，将 4T1 荷瘤小鼠随机分为四组（MB + 黑暗、EBSe + 黑暗、MB + 光照和 EBSe + 光照），然后瘤内注射 MB 或 EBSe，并进行黑暗或 660 nm 光照处理（150 mW/cm²，5 分钟）。治疗 14 天后，小鼠体重无明显变化，证明两种光敏剂均具有良好的生物安全性。此外，肿瘤组织的免疫荧光染色显示，EBSe 经光照后可显著下调 GPX4 水平，伴随绿色荧光减弱，表明该策略在肿瘤中诱导了铁死亡。同时，我们观察到 “EBSe + 光照” 组小鼠的肿瘤体积明显小于其他组。手术切除肿瘤并称重，结果显示 “EBSe + 光照” 组的肿瘤生长抑制率（TGI）达到 72.4%，而 “MB + 光照” 组仅为 34.0%，表明 EBSe 介导的光动力治疗在抑制缺氧肿瘤增殖方面比 MB 更有效。在双侧皮下接种 4T1 肿瘤的小鼠模型中研究了 MB 和 EBSe 的光刺激抗肿瘤免疫治疗。将小鼠背部右侧皮下肿瘤定义为原发肿瘤，左侧皮下肿瘤定义为远处肿瘤。当原发肿瘤生长至 40-60 mm³ 时，将小鼠随机分为 PBS、MB 和 EBSe 组，每 2 天仅对右侧肿瘤进行瘤内注射 PS 或 PBS，并进行 660 nm 激光治疗（150 mW/cm²，5 分钟）。所有组小鼠的体重均无显著变化，表明治疗过程中的生物安全性。经过 2 周的光疗，EBSe 组小鼠的肿瘤体积生长受到显著抑制，原发肿瘤和远处肿瘤的 TGI 分别为 68.2% 和 75.6%。同时，MB 组对原发肿瘤和远处肿瘤的 TGI 分别仅为 38.2% 和 25.5%，表明其抗肿瘤免疫治疗性能相对于 EBSe 组并不理想。此外，EBSe 组的肿瘤重量明显小于其他组小鼠；特别是，EBSe 组的远处肿瘤重量比 MB 组低 54%。
总结
我们成功构建了一种不依赖氧气的光敏剂 EBSe，其可通过近红外光触发的铁死亡 / 焦亡 / 胀亡协同作用，激活针对缺氧肿瘤细胞的免疫反应。通过对 MB 进行简单的硒取代和乙基化修饰，赋予了 EBSe 更高的三线态产率和亲脂性，使其在缺氧条件下对 4T1 细胞的光毒性显著增强（>2500 倍），并具有优异的光毒性指数（PI>32,000）。EBSe 的不依赖氧气特性归因于其自适应光催化能力，在常氧条件下可高效生成 I 型 / II 型活性氧（ROS），而在缺氧条件下则产生碳自由基。有趣的是，EBSe 主要积聚在溶酶体中，光照后导致溶酶体功能障碍和渗漏，随后迁移至细胞核并造成严重的 DNA 损伤。此外，这些光动力治疗诱导的细胞器损伤引发了包括焦亡、铁死亡和胀亡在内的多种非凋亡细胞死亡途径，协同激活了 4T1 荷瘤小鼠体内强大的抗肿瘤免疫反应。本研究为开发针对缺氧肿瘤细胞的高性能光催化剂提供了可靠策略，该策略在临床转化和其他光催化应用中显示出巨大潜力。
参考文献
Photoinduced Synergism of Ferroptosis/Pyroptosis/Oncosis by an O20Independent Photocatalyst for Enhanced Tumor Immunotherapy,Shankun Yao, Fengwu Xu, Ying Wang, Jizhen Shang, Shumeng Li, Xinyu Xu, Zhipeng Liu, Weijiang He, Zijian Guo,* and Yuncong Chen*,J. Am. Chem. Soc. X,https://doi.org/10.1021/jacs.4c17268
