内容提要
本研究在D-A-D分子中引入了咔唑基团，由于分子间距离更大，导致聚集态的荧光猝灭减少。通过适当的咔唑基团工程，纳米颗粒的发射光谱可以红移，峰值超过1000 nm，最亮的TBTC-4纳米颗粒成功应用于小鼠肿瘤微转移成像，转移灶直径小至0.5 mm， FGS中具有良好的临床应用前景。
本研究在D-A-D分子中引入了咔唑基团，使得整个基团的键长更加均匀，使得烷基链从共轭平面更加垂直地延伸，从而增加了分子间的距离。基于这种思想，在双（2-羟基苯基）-（2（烷基噻吩）−苯并双（噻二唑），一种具有有效NIR-II发射的D-A-D分子，以改善其体内NIR-II性能。与常用的烷基取代芴（TBTF）取代的S-D-A-D-S分子相比，咔唑及其衍生物的引入显著增加了NIR-II范围内的摩尔消光系数和QY，特别是在纳米颗粒的聚集状态下。将分子包封在具有1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基]（聚乙二醇-2000）（DSPE-PEG 2000）通过纳米沉淀法,获得高水溶性和生物相容性。通过DSPE-PEG 2000-FA的加入引入了FA 34，并通过透射电子显微镜（TEM）对其进行了表征。通过动态光散射（DLS）测定的水合尺寸约为20 - 30 nm，由于水合聚合物链的表面电晕，其大于TEM测量值。测得纳米颗粒的反电势比-30 mV更负，当表面上存在FA时，其增加至−23.1 mV。
我们研究了咔唑衍生物取代的D-A-D分子的光物理性质。首先，记录了它们在四氢呋喃（THF）中的吸收和发射以及它们在水中的纳米颗粒。如图3所示，TBTC-1的峰值波长与TBTF相比保持不变，这表明咔唑取代芴对D-A-D分子的电子分布没有显著影响，这一发现与计算的HOMO和LUMO很好地吻合。正如预期的那样，TBTC-2、TBTC-3和TBTC-4的光谱在对咔唑部分进行适当修饰后发生了红移，其吸收和发射光谱数据与激发态S1和基态S 0之间的光学间隙36模拟非常一致。纳米粒子包裹后，分子的吸收光谱发生红移，在808 nm处吸收增强，纳米粒子TBTC-2至TBTC-4的发射峰红移超过1000 nm，而TBTF和TBTC-1则表现出明显的减色位移，这表明TBTC-2对TBTC-1的影响不大。4纳米颗粒在NIR-II窗口中可能具有更好的成像性能。为了进一步评估TBTC-4用于体内成像的潜力，除了DSPE-PEG 2000之外，还包括Pluronic F127和PS-PEG 2000的各种两亲聚合物，将TBTC-4分子包裹在纳米颗粒中，并记录了相同浓度下纳米颗粒的荧光光谱尽管PS-PEG 2000纳米颗粒表现出比用DSPE-PEG 2000形成的那些略强的荧光，可能是由于更刚性的聚合物基质。
由于纳米颗粒在水溶液中表现出优异的NIR-II荧光，我们探索了它们在体内成像中的潜在应用。首先，使用CCK 8测定法在4 T1、MCF-7、293 T和MCF 10A细胞中评估纳米颗粒的细胞毒性48 h后显示无毒性。我们在小鼠体内进行血管成像，以确认纳米颗粒在体内的NIR-II性能。将纳米颗粒静脉注射到裸鼠体内后，使用小动物NIR-II成像系统观察后肢血管。尽管这五种纳米颗粒在1000 nm以外的发射信号相似，但它们在1300 nm长通。在这个范围内，TBTF和TBTC-1纳米颗粒的荧光强度很低，信号与背景几乎没有区别。相比之下，TBTC-2−TBTC-4纳米颗粒由于光谱的红移，在1300 nm以上具有更强的NIRII荧光发射。SBR要高得多，证明了使用更长波长进行体内成像的优势。值得注意的是，TBTC-4在所有纳米颗粒中具有最高的亮度，为后肢血管成像提供了最佳性能，SBR大于2。考虑到TBTC-4纳米颗粒在血管成像中的上级NIR-II荧光性能，研究了它们的穿透性，并且可以通过1 cm厚的鸡胸组织检测到信号将T1细胞注射入BALB/c雌性小鼠的乳腺脂肪垫中，建立原位乳腺癌模型，将FA功能化的TBTC-4纳米颗粒静脉注射到小鼠体内，并在注射后的不同时间点捕获NIR-II图像在注射后2小时可清楚地检测到肿瘤信号，并且SBR在注射后12小时达到最大值。为了研究纳米颗粒的分布，获得了小鼠的解剖图像。纳米颗粒主要位于肝脏、脾脏和肿瘤中，在心脏、肾脏或肺中没有检测到信号相反，当没有掺入FA靶向单元时，TBTC-4纳米颗粒在乳腺肿瘤中显示出较差的积累，表明纳米颗粒主要在肝胆清除代谢途径中。SBR显着下降，表明FA靶向基团在乳腺癌成像中的关键作用。然后研究TBTC-4纳米颗粒的代谢，肝内信号在注射后24 h达到高峰，此后逐渐下将，肝和肾功能保持不受影响，因为在碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血尿素氮（BUN）、或尿酸（UA）。
观察到NIR-II信号在肿瘤内不均匀分布，与使用1000 lp滤波器相比，使用1100 lp滤波器更清楚地反映了这一点，绘制了来自这两个图像中的感兴趣区域（ROI）的信号强度，显然，收集超过1100 nm的范围内的信号提供了更详细和准确的分析。考虑到超过1300 nm的信号相对较弱并且具有弱NIR-II信号的较小组织可能被忽略，使用1100 lp滤波器似乎更适合于研究肿瘤转移成像。
为了建立肿瘤转移模型，将4 T1细胞静脉注射到BALB/c雌性小鼠中。1周后，由于4 T1细胞的高度侵袭性，存在远处转移。将FA功能化的TBTC-4纳米颗粒静脉注射到小鼠中，然后在NIR-II成像系统下拍摄小鼠的图像。8小时后，在几个部位观察到NIR-II信号，除了明亮的肝脏和脾脏之外，还检测到几个具有NIR-II发射的小组织，包括腋窝附近的一块组织，胸腔中的两个组织，腹膜中的两个组织，以及肠中的一个组织。正如预期的那样，癌细胞存在于所有组织中，右栏显示了癌细胞侵入区域的放大图像。值得注意的是，切除的组织包括一些健康组织，因为荧光引导不受仪器的实时限制。这些转移瘤很难通过传统的手术方法识别，因为一些转移瘤位于深层组织中，直径小于2 mm。然而，通过使用明亮的TBTC-4纳米颗粒的NIR-II成像，清楚而准确地观察到转移，最小的转移直径测量为0.5mm。这表明了该试剂的优越性及其在FGS中的潜在应用。
总结
我们在D-A-D分子中引入咔唑取代芴，并开发了一系列咔唑衍生物取代的TBTC分子，这些分子被封装在纳米颗粒中时表现出显着改善的NIR-II电子物理性质。咔唑取代的D-A-D分子，特别是TBTC-4，在808 nm处表现出高摩尔消光系数，并且在NIR-II窗口中表现出QY，使其成为用于体内肿瘤和转移成像的最亮的D-A-D分子纳米颗粒。单位，TBTC-4纳米颗粒成功应用于小鼠4 T1肿瘤和转移成像。具有NIR-II信号的组织被证实被4 T1癌细胞侵袭，检测到的最小转移直径约为0.5 mm，这表明TBTC-4纳米颗粒具有作为临床FGS的潜在应用。
参考文献
Carbazole Engineering in D−A−D Molecules to Improve the NIR-II Performance for Tumor Micrometastasis Imaging，Le Fang,*, Rui Ai, Maria Eugenia Sandoval-Salinas, Lei Tan, Chun Liu, Qiang Wen, Huarong Tang, Tao Zhu, Rachel Crespo-Otero,* Xiaohong Fang*，Nano Lett. 2025, 25, 9433−9440, https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5c02001
