内容提要
本研究报告了EC5染料的新型探针设计策略的合理开发。利用该方法制备的EC 5-H3是一种强氧化性的探针，其优点包括具有超高的转化率和较高的灵敏度，可用于高氧化性物质的检测。EC 5-H3在体内对药物诱导的肝脏氧化损伤的生物传感显示了EC 5-H3在实际应用中的可行性。利用共聚焦显微镜可以对组织损伤进行成像，揭示不同肝脏氧化损伤的异质性细胞。
结果和讨论
本研究报道了一种基于EC 5不对称还原的高性能NIR荧光探针（EC 5-H3）。由于螺环化是用咕吨染料开发关-开探针的稳健方法，我们计划将这种化学转化为EC 5根据该策略设计并合成了四种ROS探针，EC 5 S、EC 5-Se、EC 5-PDA和EC 5-NNH2，用于检测各种过氧化物。为了阐明原因，然后测试了EC 5-S/EC 5-Se对Hg2+的反应性，因为S/Se也表现出对Hg2+的高亲和力。尽管在中性HEPES缓冲液中没有观察到荧光开启，但如果在中性HEPES缓冲液中进行Hg2+滴定，则EC 5-S/EC 5-Se在吸收和荧光两者中产生显著开启。很明显，基于EC 5的螺环化探针在水性介质中打开其螺环的相对阻力是以下两个因素的组合结果。首先，与NR2头基的氢键阻碍了其供电子能力，导致开环困难。其次，与苯环相比，萘单元更难失去其芳香性。
当在−20°C下进行NaBH4介导的EC 5还原时，在中心次甲基碳上发生还原，产生具有蓝色荧光的EC5-H1。为了促进在较不亲电但空间上较易接近的醌甲基化位点的亲核攻击，将反应温度升高至室温，这次我们通过TLC观察到黄绿色荧光产物的出现，其被证实是所需异构体EC5-H2 EC5-H1和EC5-H2中不同氢原子的化学位移分别在5.99和3.63/3.45 ppm处显著不同。与EC 5-H2相比，EC 5-H1中的氢原子被邻近的三个芳环去屏蔽，导致化学位移较大，化学位移的差异表明它们可能具有不同的氧化反应活性。光谱滴定在HEPES缓冲液（10 mM，pH = 7.4，HEPES：DMF = 1：1，v/v）中进行，当ONOO-或ClO-加入到EC 5-H1溶液（5 μM）中时，没有观察到吸收或荧光开启，表明其C─H键对H-夺取B的反应性很差。ONOO−或ClO−黑色虚线表示相同浓度下EC 5-Me的吸收光谱，假设探针定量转化为产物同样，·OH也不能激活探针。相反，EC 5-H2与ONOO-或ClO-反应，产生所需的吸收和荧光开启。然而，在840 nm处的吸光度达到最大值，仅为约0.15，约为理论值的21%。进一步加入过量的ONOO-或ClO-导致吸光度降低。
为了抑制ONOO−对EC 5支架的亲核攻击，可以在底部苯环的C-2和C-6位置安装两个更大的基团，通过空间位阻提高化学稳定性。为此，制备了2，6-二甲氧基苯基锂试剂，并与6反应，得到高度稳定的染料，在各种溶剂中测量EC 5-Me和EC 5 - 2 OMe的光物理性质。EC 5-Me和EC 52 OMe表现出相似的吸收和发射最大值，而后者相当亮。EC 5 - 2 OMe表现出长于870 nm的发射峰、超过1000 nm的明亮发射尾、高量子产率（F = 0.21）和长荧光寿命（τ = 1.6 ns）。此外，它们对一系列活性氧物种的化学稳定性（如ONOO-、ClO-和H2O2）和亲核试剂在HEPES缓冲液中评价了GSH和Cys（例如GSH和Cys）。EC5-2OMe显示出比EC 5-Me更高的化学稳定性，EC 5-Me和EC 5 - 2 OMe的光稳定性也以ICG为参比进行了测试。在808 nm激光照射下，与EC 5-Me和ICG相比，EC 5 - 2 OMe表现出更高的光稳定性。在室温下用NaBH4还原EC 5 - 2 OMe，并且仅发生在醌甲基位点而不是最缺电子的中心次甲基碳，以93%的产率提供具有强黄绿色荧光的所需EC 5-H3。EC 5-H3中两个氢原子的化学位移为3.61 ppm，这与EC 5-H2中的化学位移相似。使用不同的活性氧进行EC 5-H3的滴定。首先，发现H2O2和O2·−难以氧化EC 5-H3。当加入O2·−时，观察到检测产物在840 nm处的吸收和在890 nm处的发射的剂量依赖性增加，探针在405 nm处的吸收和在530 nm处的发射沿着降低。EC 5-H3和O2·−之间的反应动力学非常快，并且信号增加通常在几秒内达到平台。考虑到EC 5-H3在NIR区域中不吸收或发射，由于零背景信号，分别计算出吸收和发射滴定的172倍和195倍的超高开启比。（0.84）与理论值非常接近（0.92），表明EC 5-H3被·OH氧化是高效的，并且所产生的EC5-染料抵抗·OH的进一步氧化破坏。ONOO-和ClO-的吸收和发射开启的动力学和程度与·OH基本相同，并且实现了214倍的超高荧光信号比。·OH和ONOO-的检测限（LOD）计算为51.1和8.8 nM，分别加入ONOO−后EC 5-H3的吸收和发射光谱与EC5-2OMe的吸收和发射光谱重叠良好，表明氧化产物为EC5-2OMe。ClO−与EC 5-H3的反应性相对较低，过量ClO−（80 µM）不能完全氧化探针。
我们进一步测试了EC 5-H3使用我们自制的近红外荧光显微镜进行近红外共焦荧光成像的能力。为了评估EC 5-H3（探针）和EC 5 - 2 OMe（产物）的潜在细胞毒性，进行标准CCK-8测定。探针和染料都显示最小的细胞毒性。对于细胞内ROS成像，SIN-1用SIN 1（500 μM）处理的细胞显示出明显的荧光增强。当使用FeTPPS（一种已知的ONOO−清除剂）时，荧光增强被抑制。在外源ONOO−成功成像后，用LPS和IFN-γ处理的细胞显示出强烈的荧光。通过用尿酸预处理抑制。此外，不同放大倍数下荧光强度的差异非常明显。肝脏是抵御外源性物质的主要防御系统，应尽量减少药物引起的肝损伤。多种药物因严重的肝毒性而退出市场，例如曲格列酮、溴芬酸、甲磺酸拉曲沙星和西他生坦钠。对乙酰氨基酚（APAP）过量是急性肝衰竭的主要原因。（N-乙酰基-对苯醌亚胺），一种可快速消耗GSH的活性代谢物随后是氧化应激，破坏细胞的氧化还原平衡，导致急性肝衰竭。因此，因此，研究EC 5-H3检测APAP诱导的肝损伤的可行性，首先，在细胞水平上，用APAP处理细胞，（0.25、0.5和1 mM）导致EC 5-H3的剂量依赖性荧光增强。（NAC，肝毒性的抗氧化药物）孵育1小时，导致与EC 5-H3与对照组相比。这些结果表明，EC 5-H3可用于使用共聚焦荧光显微镜在细胞水平上监测ROS波动。
BALB/c小鼠被随机分为5组，每组5只第一组腹腔注射PBS作为对照，第二至第四组腹腔注射不同剂量的APAP（150、300和500 mg kg−1），最后一组在注射APAP（300 mg kg −1）前用NAC（300 mg kg−1）预处理。所有组均注射EC 5-H3（2 mg kg−1，在注射APAP后12小时，通过尾静脉注射含10%DMSO的PBS缓冲液）。使用小动物成像仪器监测体内荧光图像8小时。激光激发为808 nm，120 mW cm-2，通过1100 nm长，对照组表现出荧光的轻度增加，这归因于肝脏中的基础氧化代谢。小鼠耐受性良好，并且没有引起肝脏区域荧光发射的显著增强。两组之间的平均荧光强度差异无统计学意义。相比之下，小鼠肝脏中的荧光强度在300或500 mg kg−1 APAP处理组中显示出显著增加此外，最后一组表现出荧光的显著降低，表明用NAC预处理可以抑制但不能完全抑制小鼠肝脏中的氧化应激，这可能是由于NAC的剂量不足以抵消大量APAP的摄入。 EC 5-H3的一个显著优点是其在肝脏区域的荧光在代谢排泄之前持续至少8 h，这表明EC 5-H3用于长期体内生物成像的潜力，肝脏和脾脏中的荧光强度较高,总体而言，上述结果清楚地表明，EC 5-H3是用于实时、长期体内监测APAP诱导模型中ROS的有前途的工具。
总结
我们提出在醌甲基化位点进行不对称共轭加成的想法，并开发了一种近红外荧光探针EC 5-H3。它对ONOO−和·OH表现出高反应性，产生约200倍的荧光开启，这表明EC 5-H3是一种检测高氧化性自由基的合适探针。H3在APAP处理的小鼠模型中显示了体内生物传感，EC 5-H3捕获了肝脏区域的剂量和时间依赖性荧光增强。肝脏中的信号保持稳定超过8 h，而没有因排泄而显著降低。探针的亮度允许以显微镜分辨率监测肝脏氧化损伤。
参考文献
Near-Infrared Biosensing of Drug-Induced Cell-Heterogeneous Injuries with an Ultrahigh Turn-On Ratio,Xinru Hu,Cheng Yao, Baosheng Wang, Yuyang Zhang, Jinwen Yang, Yan Dong, Yi Li, Danyang Wang, Xiaohua Chen, Yanyan Deng, Guangbo Ge,* Ben Zhou,* Xiao Luo,*Xuhong Qian, and Youjun Yang*，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e20250357，DOI.org/10.1002/anie.202503579.
