内容提要
本研就提出一种650 nm以上激发和发射的新策略：罗丹明的偕甲基被三氟甲基（CF3）基团取代。CF3基团在光学轮廓中显著红移超过90 nm，产生具有>650 nm的激发和发射曲线和高亮度的染料框架；CF3基团通过无色内酯和有色两性内酯形式的开-闭平衡的位置。本文通过独特的后期功能化策略获得十几种新染料，探索在免清洗细胞内标记、化学遗传学指示剂功能成像和活细胞中的单分子跟踪。
实验结果与讨论
能隙的计算确定：我们比较了一系列具有二甲基碳、二甲基硅或双-CF3基团的TMR衍生物的计算HOMO−LUMO能隙。理论计算BF罗丹明的HOMO-LUMO能隙为2.46 eV，明显小于CarboTMR的差距BF罗丹明的最大吸收峰为2.60 eV，略小于二甲基硅的最大吸收峰（2.48 eV），这表明BF罗丹明在NIR区域具有最大吸收。然而，与CarboTMR相比，中性诱导效应对HOMO能级的影响最小。双（三氟甲基）碳的吸电子性质导致BF罗丹明的LUMO能量比二甲基硅罗丹明更低。强吸电子的双（三氟甲基）亚甲基也将HOMO能级降低到CarboTMR和二甲基硅罗丹明的HOMO能级以下。
染料的合成
传统的合成方法对BF罗丹明有两个明显的限制。首先，我们不能重复地引入在芳环上含有多于一个基团的侧环。我们还限制了通过这种烷基化策略可以合成的助色剂的数量。令人欣慰的是，新的BF罗丹明显示出远红外吸收和发射，λmax为650 nm，发射最大值为661 nm。比母体CarboTMR（2）红移约40 nm，比可比较的SiR略红这些吸收最大值。
我们开发了一种替代策略以提高羰基的亲核加成，同时还能够快速获得许多所需的助色剂。我们假设苯胺9转化为溴化物会降低亲电羰基的尿素样特征并增强其对有机金属物种的反应性二苯胺9可以通过与CuBr 2和亚硝酸叔丁酯的Sandmeyer反应以76%的产率转化为二溴化物18。二溴化物18在LaCl 3 - 2LiCl 31存在下容易地与芳基镁反应，三苯甲基醇19提供了通过Buchwald-Hartwig偶联使罗丹明染料的氮取代多样化的关键中间体。各种胺可以与三苯甲基醇19偶联。仲胺是合适的偶联配偶体。四甲基4a和四乙基4 b染料以68%和74%的产率从19中分离。通过该新路线的4a的产率低于我们的第一路线，但提供了显著更大的合成灵活性。
双官能化染料的合成
尽管可以将单取代的受保护的羧酸酯，但被受保护的羧酸双取代的芳基环不是底物。可以添加体积较小的二甲基芳基环。将（2，5-二甲基苯基）溴化镁加到18中，然后用Cr（VI）进行苄基氧化，得到（20）。随后的t-Bu保护得到双官能化的中间体21。通过C-N偶联得到胺，在t-Bu脱保护后以66 - 73%的产率得到TMR BF 646（8a）和氮杂环丁烷BF 648（8b）染料。双官能化BF 646和BF 648具有与相应SiR染料几乎相同的吸收、发射和荧光量子产率值一个区别是新的BF罗丹明具有较低的消光系数，这表明平衡向透明内酯移动。具有低KL-Z值的染料（有利于封闭内酯）或高D50 BF染料（表明低开放倾向）具有荧光结合自标记蛋白质（如HaloTag）的潜力。BF染料具有低KL Z值（0.0022至<0.0001）和D50值>79。这两个值都表明BerkeleyFluors染料具有高荧光性的潜力，因为含水KL-Z有利于内酯形式。较小的KL-Z值可能是由于内酯的稳定性或两性离子的不稳定性。BF染料在C-9位置上的正电荷特性相对于可比硅物种略高羧基取代的BF染料在生理pH下显示低吸光度，对毫摩尔浓度的谷胱甘肽稳定，表明对于活细胞成像的相容性。
细胞成像
BFHTL染料有效地标记表达HaloTag的细胞。表达核定位HaloTag并用任一染料染色的HEK293 T细胞显示明亮的荧光。荧光定位于细胞核，如核特异性Hoechst 33342染色的共定位所证明的BF染料荧光的定位可以通过HaloTag融合蛋白的表达来控制。表达不同HaloTag融合蛋白的细胞能够标记亚细胞结构，如细胞核，线粒体或内质网。所有BF标记显示与市售细胞器标记物的良好相关性。我们假设BF染料将是活细胞中荧光HaloTag标记的良好候选物，这是基于它们的低KL-Z值、高D50值和大的体外荧光性。所有SiR（SiTMR和氮杂环丁烷官能化的JF 646）和BF罗丹明（TMR衍生的BF 646和氮杂环丁烷衍生的BF 648）染料在细胞中显示荧光标记，如通过在洗涤或无洗涤成像条件下细胞亮度的微小差异所证明的。在表达HaloTag的细胞中，BFHTL染料的荧光强度是同源SiRHTL染料亮度的37 - 85，与体外HaloTag结合结果一致，然而，BFHTL染料的荧光性非常高，我们将荧光性定义为染料在HaloTag中的亮度的比率，表达细胞与非表达细胞中相同染料的亮度。BFHTL染料在活细胞中的荧光性>1200×（BF 646-HTL）和> 10，000 ×（BF 648-HTL），而SiTMRHTL和JF 646 HTL分别显示60×和466×的细胞荧光原性。与传统的硅罗丹明染料相比，BF染料显示出>30倍至>20倍的荧光性增加，但整体亮度降低了1.2倍至2.7倍的数量级。
这种高荧光性源于缺乏HaloTag的细胞中BFHTL染料的接近零的背景细胞荧光。来自不表达HaloTag的细胞的荧光与背景无法区分，甚至高达2500 nM的浓度。SiRHTL染料中非特异性背景荧光的增加大于BFHTL的增加，BF染料的漂白速率低于它们的同源SiR染料的漂白速率。这些实验表明BF染料有效地标记活细胞中的HaloTag，显示出超过SiR的光稳定性，并且在体外和细胞成像背景下都具有显著的荧光特性。表达Voltron并用BF 646-HTL标记的HEK 293 T细胞显示明亮的质膜相关荧光。BF 646-HTL-Voltron（BFV 646）的荧光是电压敏感的。双全细胞膜片钳电生理学和荧光成像显示电压灵敏度约为每100 mV −4.9% ΔF/F（± 0.5%，平均值的标准误差，峰值响应）。如前所述，一些电致变色FRET指示剂如Voltron显示电压依赖性滞后。我们观察到相同的现象，稳态电压阶跃的电压灵敏度略低，为−3.3% ΔF/F（± 0.4%，）。这与Voltron 635，47相比是有利的，Voltron 635，47对于稳态和峰值响应具有-3%和-5%之间的电压灵敏度。这些数据表明BF染料在电压成像的光子缺乏条件下表现得令人钦佩。
在相关的方式，单分子定位显微镜和跟踪需要明亮和光稳定的荧光团，以精确定位活细胞中的单个粒子。BF罗丹明与高度倾斜的层压光学片（HILO）显微镜配对时，可以在活细胞中对HaloTag融合进行单粒子跟踪。BFHTL染料可以通过HaloTag融合到各种靶点，包括组蛋白（H2 B）、转录因子（Sox 2）或RNA结合蛋白（HEXIM 1），定位于细胞核。在单分子水平上，BF 646-HTL或BF 648-HTL标记的H2 B的单个定位的荧光强度分布相似，尽管BF 648-HTL高出约3%（平均值，10，200;中位数，9500）比TMR衍生的BF 646-HTL（平均数为9 800;中位数，9200）这与体外亮度测定很好地相关，其中，与HaloTag结合的BF 648-HTL的亮度比BF 646-HTL的亮度大约10 BFHTL染料在U2OS细胞中的单分子定位可用于追踪这些分子的单分子轨迹，从而允许解剖活细胞中的转录生物化学。使用已建立的单分子跟踪显微镜和分析方法，BF 648-HTL揭示了组蛋白H2B和RNA结合蛋白HEXIM 1迁移率的差异。大多数H2B定位显示低扩散系数，与染色质相关组蛋白一致（黑色）。另一方面，HEXIM1只显示了一小部分慢扩散体和两个扩散较快的亚群（2.7和7.4 μm2 /s）（洋红），与结合至PTEFb的HEXIM 1分子的缓慢扩散群体一致：7SK核糖核蛋白复合物和未结合P-TEFb：7SK的快速扩散群体。
结论
我们报告了一类新的双（三氟甲基）碳罗丹明或BF染料。BF染料可以转化为荧光HaloTag配体。BF HaloTag配体在体外结合HaloTag时显示出>10−20倍的荧光强度提高，与SiR配体相比，在活细胞成像中显示出>10−30倍的荧光强度提高。BF罗丹明即使在苛刻的光饥饿显微镜条件下也表现良好，可以集成到现有的最先进的成像模式中，如电压成像或HiLo显微镜的单粒子跟踪。BF 646和BF 648 HaloTag配体都能够在活细胞中对HaloTag融合蛋白进行单粒子追踪，并揭示了必需的核组分组蛋白H2 B和RNA结合蛋白HEXIM 1的迁移率差异。
参考文献
Bis(trifluoromethyl)carborhodamines: Highly Fluorogenic, Far-Red to Near-Infrared Dyes for Live Cell Fluorescence Microscopy,Activity-Based Sensing, and Single-Molecule Microscopy，Nels C. Gerstner,Jack T. McCann, Julia G. Martin,Katharine M Henn, Kathrin Riske,Sathvik Anantakrishnan, Thomas G.W. Graham, Xavier Darzacq, and Evan W. Miller*，J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 21950，https://doi.org/10.1021/jacs.5c05473.
