内容提要
本文报道两种生物正交小分子连接物：氯代烷烃-四嗪（chloroalkane-tetrazine，CA-Tz）和氯代烷烃-叠氮（chloroalkane-azide，CA-N3），我们用两种可点击的硅罗丹明染料（SiR-PEG 3-TCO和SiR-PEG 4-DBCO）比较了它们的标记能力。共聚焦成像结果表明，使用CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO染料显示出上级的细胞内标记，具有低非特异性信号。全内反射（TIRF）成像表明SiR染料在相同的激发条件下表现出上级光稳定性，使其适合于长期细胞成像。SiR染料标记在四阶超分辨光学涨落成像（SOFI）中也显示出比普通蛋白质更高的结构保留率。本研究提出了可点击HaloTag接头作为活细胞标记和成像的有效工具，突出了氯代烷烃接头和可点击染料用于活细胞成像的高质量标记。
结果与讨论
可点击HaloTag配体的合成
我们设计并合成了两种可点击的HaloTag配体CA-Tz和CA-N3，用于活细胞标记和成像，显著提高了标记过程的特异性和效率。说明了用可点击的HaloTag配体和SiR染料标记活细胞微管的过程。首先，将HaloTag基因整合到在C-末端含有微管相关蛋白的载体中，以构建携带HaloTag基因的质粒。与转染试剂一起沿着转染到活细胞中，以确保HaloTag蛋白在微管结构上的有效表达。接下来，将两种小分子接头分别与表达HaloTag蛋白的细胞一起孵育，使它们与HaloTag蛋白共价结合。最后，将细胞与可点击的SiR染料一起孵育，其中两个小分子连接体通过点击化学反应与相应的染料共价键合，两个可点击的HaloTag配体。SiR染料具有优异的光稳定性、pH不敏感性、扩展的波长范围、高荧光量子产率和良好的细胞渗透性，其高度适用于生物医学成像和细胞分析。因此，我们使用可点击的SiR °荧光团SiR-PEG 3-TCO和SiR-PEG 4-DBCO来评估可点击的HaloTag配体的靶向特异性和标记质量。
用可点击的HaloTag配体和荧光团标记的活细胞微管的荧光成像
鉴于CA-Tz和CA-N3的低分子量，我们假设它们可以有效地穿透细胞膜并快速进入细胞，。从而能够靶向亚细胞结构。为了验证CA-Tz和CA-N3的微管靶向性能，我们用质粒mEmerald-Halo-Ensilon瞬时转染COS 7细胞，该质粒将HaloTag融合到微管相关蛋白Ensilon上然后使用在微管内表达HaloTag融合蛋白的COS-7细胞来评估微管靶向CA-Tz或CA-N3的性能。我们将转染的COS-7细胞与10 M CA-Tz或CA-N3共孵育0.5 h，然后分别与10 M SiR-PEG 3 TCO或SiR-PEG 4-DBCO反应4 h。结果表明，CA-Tz和CA-N3可被有效地递送到细胞质中，并显示出上级的微管标记靶向特异性。然而，微管的CA-N3标记显示出强背景噪声和低信噪比。
我们将转染的COS-7细胞与10 M CA-Tz或CA-N3共孵育过夜，然后用可点击的SiR染料孵育4小时。结果表明图像信噪比得到改善。通过使用CA-Tz和SiR-PEG 3 TCO实现了具有低非特异性信号的上级细胞内标记。在转染的COS-7细胞微管中表达的mEmerald促进了SiR染料的共定位研究。SiR染料的发光度（红色通道）几乎与mEmerald的发光度完全重叠（绿色通道）。白色框内微管沿着x轴的平均强度分布曲线显示出几乎相同的趋势，进一步确认有效的共定位相反，通过使用CA-N3和SiR-PEG 4-DBCO标记仍然可以观察到强背景信号，可能是由于活细胞内SiR-PEG 4-DBCO聚集的趋势,虽然SiR染料的发光度几乎与mEmerald的发光度重叠，仍然存在显著的非特异性信号-3。
我们将转染的COS-7细胞与10 M SiR-PEG 3-TCO或SiR-PEG 4-DBCO在不存在CA-Tz或CA-N3的情况下共孵育4小时。结果表明，单独的SiR-PEG 4-DBCO。SiR-PEG 3-TCO在细胞内产生显著的背景噪声，可能是由于其在活细胞中的聚集倾向。相比之下，SiR-PEG 3-TCO在图像共定位和强度分布曲线中几乎没有表现出非特异性信号。这些结果表明，CA-Tz和CA-N3能够靶向表达HaloTag蛋白的活细胞微管，通过使用CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO染料实现了上级细胞内标记和低非特异性信号。然而，观察到强背景信号。用CA-N3和SiR-PEG 4-DBCO标记。因此，在相同的标记和成像条件下，CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO产生更高质量的图像，更适合用于活细胞微管的标记和成像。
与绿色荧光蛋白相比，硅罗丹明允许更长的成像持续时间
我们评估了CA-Tz和SiR-PEG3-TCO在标记活细胞微管时的光漂白性能。我们使用mEmerald作为对照，并将其抗光漂白性与CA-Tz和SiR-PEG3-TCO进行比较。即使在60秒成像后，仍然可以观察到来自CA-Tz和SiR-PEG3TCO的强荧光信号。由于光漂白，mEmerald的发光强度迅速下降。在40秒的持续照射后，mEmerald的发光强度几乎完全漂白，而CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO的发光强度保持约50%。这些结果表明CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO标记的电池表现出诸如高亮度。和很强的光稳定性，使它们非常有希望用于长期超分辨率成像。
活细胞微管的SOFI成像
我们展示了CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO在SOFI中的应用。我们用CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO在活COS-7细胞中标记表达mEmerald的微管。SiR染料和mEmerald都显示出高信噪比。我们对CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO标记的微管结构的二阶、三阶和四阶交叉累积量进行了SOFI分析，以及绿宝石。与mEmerald图像相比，SiR染料标记的图像在四阶SOFI图像中显示出更高的图像保持率，我们进一步艾德和比较了图像中虚线框内的结构。沿着白色虚线的强度分布表明，SiR染料标记的微管结构在宽视场和四阶SOFI图像中的强度分布曲线表现出几乎相同的趋势和峰值。相反，与广角图像相比，表达mEmerald的微管结构的四阶SOFI图像的强度分布曲线显示出两个缺失的峰。这表明SiR染料标记的微管结构在广角图像和四阶SOFI图像中几乎保留了所有的结构细节，而表达mEmerald的微管结构表现出显著的损失。染料标记的微管结构在四阶SOFI图像中具有更高的留存率，突出了SiR染料标记的优越性。此外，与宽场图像相比，用CATz和SiR-PEG 3-TCO标记的活细胞微管的分辨率显著提高。用白色箭头突出显示的微管强度光谱的半峰全宽（FWHM），表明与平均宽视场图像（332 nm）相比，四阶SOFI（161 nm）的分辨率提高了两倍，而mEmerald的四阶SOFI微管图像的分辨率仅为189 nm。
总结
我们已经开发了两种用于活细胞的可点击HaloTag配体CA-Tz和CA-N3。微管标记和超分辨率成像。通过将氯代烷烃部分和点击化学功能基团整合到小分子中，已经开发了新的基于氯代烷烃的HaloTag蛋白底物。这种设计促进了活细胞中的点击化学反应，使得能够高效地标记和成像亚细胞结构。与通常用于活细胞成像的传统绿色荧光蛋白相比，用CA-Tz和SiR-PEG 3-TCO标记的微管显示出上级的光稳定性。此外，CA-Tz和SiRPEG 3-TCO的组合比CA-N3和SiRPEG 4-DBCO的组合具有更好的标记质量和更低的背景噪声。这可能归因于SiR-PEG 4-DBCO在活细胞内的囊泡中聚集和积累的趋势。这些结果为活细胞中选择可点击的荧光染料和接头提供了有价值的指导特别地，CA-Tz和CA-N3具有低分子量、良好的细胞膜渗透性、低毒性、高特异性、稳定结合和快速细胞摄取的优点。与传统的绿色荧光蛋白相比，这些染料标记的细胞适合于SOFI，其在四阶SOFI成像中提供了超分辨率图像和相对高的显微结构保留。
参考文献
Clickable HaloTag ligands for live cell labeling and imaging,Yunhe Luo , Siyu Zhou , Mingyue Gong , Changfeng Wu and Xiaofeng Fang *, J. Innov. Opt. Heal Sci., 2025, 18, 2441003, DOI: 10.1142/S1793545824410037.
