内容提要
用于治疗结核病的传统抗生素存在耐药性和多种并发症。我们提出了一种病灶-病原体双重靶向策略，通过将分枝杆菌刺激的巨噬细胞膜包裹聚集诱导发射的纳米粒子，用于1064 nm激光激发的光热治疗。包被的纳米颗粒携带结核分枝杆菌的特异性受体，这使它们能够同时靶向结核性肉芽肿和内部结核分枝杆菌。在TB小鼠模型中，静脉注射纳米颗粒通过近红外区IIb的信号发射对肺内单个肉芽肿进行原位成像。在胸腔外1064 nm激光照射下，这些纳米颗粒产生的光热效应根除了靶向结核分枝杆菌，减轻了肺部的病理损伤和过度炎症。这种在近红外区域使用双靶向成像的精确光热治疗显示了结核病管理的治疗策略。
实验结果与讨论
首先合成了TPE-BT-BBTD，一种具有聚集诱导发射(AIE)特性的光热分子，在近红外区域IIb (NIR-IIb;1500 - 1700 nm)，光热转换效率显著，吸收峰最长(接近1000 nm)，是目前报道的AIE发光源(AIEgens)。接下来，通过纳米沉淀法将TPE-BT-BBTD分子包裹在聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)中。随后，分离海洋分枝杆菌预刺激巨噬细胞的细胞膜，并通过共挤出涂覆在PLGA核心上，形成BBTD@PM NPs，其中PM表示预活化膜。在h37ra诱导的肺结核小鼠体内静脉注射BBTD@PM NPs后，NPs在肺部肉芽肿中迅速积累，并成功地原位点燃了单个肉芽肿。此外，针对肉芽肿的BBTD@PM NPs渗透到肉芽肿坏死区域，通过特异性受体-配体结合靶向内部结核分枝杆菌。在来自胸腔外的1064 nm激光照射下，BBTD@PM NPs的光热行为被激活，导致靶向杀死结核分枝杆菌，并减轻肺组织的病理损伤和炎症水平。随后，收集海洋分枝杆菌刺激36 h的巨噬细胞进行转录组学分析。KEGG通路富集分析显示，M. marinum刺激的巨噬细胞富集与TB(红色)、模式识别受体(PRRs;橙色)和炎症(蓝色)。热图显示，上调的基因与促炎细胞因子、趋化因子和病原体相关受体相关。同样，基因本体(GO)分析表明，海洋分枝杆菌刺激主要促进PRRs的激活，尤其是toll样受体(TLRs);红色)，免疫和炎症反应(蓝色)。此外，差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用网络表明，M. marinum刺激的巨噬细胞主要激活免疫和炎症相关的功能通路。我们检测巨噬细胞膜表面的tlr。作为在巨噬细胞和其他免疫细胞上广泛表达的最重要的PRRs, TLRs可以识别来自多种外源微生物的独特病原体相关分子模式(PAMPs)。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-rt-qPCR)显示，随着刺激时间的增加，巨噬细胞中Tlr2、Tlr4和Tlr6基因的表达显著增加，说明Tlr2、Tlr4和Tlr6基因是海芽胞杆菌活化巨噬细胞的特征性指标。流式细胞术(表面染色)免疫荧光也显示巨噬细胞膜外表面三种tlr的表达在海洋分枝杆菌刺激过程中上调。
提取了海洋分枝杆菌刺激的巨噬细胞膜，并利用这些预活化膜(PMs)制备了精确靶向结核分枝杆菌的BNPs。为了照亮这些BNPs以评估它们在体内的生物分布，我们在NPs中引入了一种高性能的AIE活性光热剂TPE-BT-BBTD。TPE-BT-BBTD在THF溶剂中表现出极长的吸收光谱，这被认为是所有报道的AIEgens中最长的，可以用激光在980和1064 nm处激发。在1064 nm的辐照下，TPE-BT-BBTD显示出荧光发射，最大光致发光(PL)强度在1305 nm左右。我们验证了TPE-BT-BBTD在THF/water混合物中的AIE特征。随着水分数(fw)从0到40%的变化，TPE-BT-BBTD的荧光强度逐渐降低，这是由于扭曲的分子内电荷转移效应。当fw进一步增大时，TPE-BT-BBTD的PL强度相应增大，验证了其AIE性能。为了获得BBTD@PM NPs，首先将TPE-BT-BBTD通过纳米沉淀法掺入PLGA聚合物中，通过共挤出将pm涂覆在PLGA芯上。动态光散射显示，PLGA芯的平均直径为73.7 nm, BBTD@M NPs和BBTD@PM NPs的粒径略有增加。直径的增加表明巨噬细胞膜(~ 5-10 nm)成功地覆盖在PLGA核表面。此外，加入未激活和预激活的巨噬细胞膜后，zeta电位分别从- 40.2 mV (BBTD@M NPs)和- 21.3 mV (BBTD@PM NPs)变化。透射电镜图像显示，BBTD@M NPs和BBTD@ PM NPs具有典型的球形核壳结构。紫外-可见吸收光谱显示，由于封装了TPE-BT-BBTD，三种球型水溶液的吸收时间都很长，最大吸收峰红移至993 nm。在1064 nm激光照射下，与PBS相比，BBTD@PM NPs发出强烈的NIR-II荧光，在1323 nm和1542 nm处有两个发射峰。接下来，我们检测了BBTD@PM NPs中tlr的表达。SDS-PAGE显示BBTD@M NPs和BBTD@PM NPs的蛋白质组成与巨噬细胞裂解物相似，但不同(包括细胞内蛋白质)，表明巨噬细胞膜在两种NPs上保存。Western blotting分析证实BBTD@M NPs和BBTD@PM NPs均携带结核相关TLRs (TLR2、TLR4和TLR6)。
体外评价BBTD@PM NPs对M. tuberculosis的靶向能力。除了BBTD@M NPs，我们还介绍了从红细胞(RBC)膜制备的BBTD@RBC NPs进行比较。通常，BBTD@RBC NPs与BBTD@PM NPs具有几乎相同的粒径、zeta电位、核壳结构和光热性质，但不表达TLR2、TLR4和TLR6。共孵育5分钟后，dio标记的BBTD@RBC NPs与mcherry标记的H37Ra杆菌(结核分枝杆菌的减毒株)几乎没有共定位。相比之下，BBTD@M NPs对H37Ra杆菌表现出中等的靶向潜力，而BBTD@PM NPs与H37Ra明显共定位。流式细胞术显示类似结果。扫描电镜(SEM)显示，共孵育5min后，BBTD@RBC NPs几乎没有与H37Ra杆菌结合。相比之下,在相同条件下，适量的BBTD@M NPs和大量的BBTD@PM NPs均能与H37Ra杆菌表面结合。此外，BBTD@PM NPs仅能与M. marinum和H37Ra等分枝杆菌结合，而不能与其他细菌结合，表明它们具有特异性靶向能力。然后，我们研究了BBTD@PM NPs对结核分枝杆菌的靶向光热杀菌作用。活/死细菌活力测定显示，在没有1064 nm激光照射的情况下，这些NPs对结核分枝杆菌没有毒性。1064 nm激光照射下，BBTD@RBC NP组少量H37Ra杆菌死亡。此外，BBTD@M NPs和1064 nm辐照的组合导致了适量H37Ra杆菌的死亡，而BBTD@PM NPs加1064 nm辐照则导致了大多数细菌的死亡。然后我们探讨了不同治疗后结核分枝杆菌的结构变化。扫描电镜显示，BBTD@PM NPs和1064 nm激光的联合使用大规模破坏了H37Ra杆菌体，导致细菌广泛解体和破裂。本研究开发的靶向光热杀菌策略可能不会导致耐药。此外，进行了菌落形成试验，以计算不同处理后结核分枝杆菌的菌落形成单位(cfu)。在1064 nm激光照射下，BBTD@PM NPs的抗菌效果明显优于其他组。
为了实现NIR-IIb成像，我们使用了1500 nm的长通滤光片。BBTD@PM NPs在1064 nm照射下表现出浓度依赖性的荧光发射。为了评估BBTD@PM NP的NIR-IIb信号的组织穿透能力，使用不同厚度的猪肉覆盖BBTD@PM NP悬液，其中确定的最大组织穿透深度为9 mm。接下来，我们探索了BBTD@PM NPs抗光漂白的能力。在1064 nm持续照射20分钟后，BBTD@PM NPs的NIR-IIb信号与使用相同功率密度的808 nm激光照射的ICG溶液相比仍然很强，这表明BBTD@PM NPs具有优越的光稳定性。此外，我们还研究了BBTD@ PM NPs在体内的成像分辨率和生物分布。健康小鼠静脉注射BBTD@PM NPs 3分钟后，可以看到各种血管，包括位于深部的股动脉和腹腔血管。即使是直径只有140 μm的小血管也能被成功区分，这与其他aie活性nps35,36相比具有优势。为了研究BBTD@PM NPs对肉芽肿和内源性结核分枝杆菌的NIR-IIb成像潜力，我们建立了h37ra诱导的小鼠肺结核模型。H37Ra感染21天后，肺内可见大量典型结核性肉芽肿。这些肉芽肿结构紧凑(图左)，是主要由巨噬细胞组成的免疫细胞的聚集体(图中)，中心坏死部位含有大量抗酸阳性杆菌(图右)。经静脉注射到结核小鼠后，BBTD@PM NPs以极快的速度到达感染的肺部。
随后，我们探索了BBTD@ PM NPs对肺部肉芽肿的靶向能力。BBTD@PM NPs选择性地在肉芽肿中积累，导致肺部散在高荧光，通过体内NIR-IIb成像从胸部外和胸腔内清楚地识别出来。值得注意的是，在所有用对照NPs处理的TB小鼠中，肝脏和脾脏中的NIR-IIb信号明显高于肺中的NIR-IIb信号，而用BBTD@PM NPs处理的TB小鼠表现出相反的趋势，有力地证实了这种NP对结核性肉芽肿的出色靶向能力。然后处死小鼠，分离其肺进行NIR-IIb成像和组织病理学分析。与肝脏和脾脏的弥漫性荧光不同，肺组织呈现出菱形明亮荧光，具有较大的圆形超荧光区域，且荧光持续时间长，显示了BBTD@PM NPs的精确靶向和长期跟踪能力。注意，这种成像策略提供了比传统NIR-I成像高得多的分辨率，能够清晰地识别直径约0.2 mm的非常小的肉芽肿。该成像分辨率优于临床使用的计算机断层扫描(~1.0 mm分辨率)。肺组织病理学评估显示，dio标记的BBTD@PM NPs成功进入肉芽肿的中心坏死部位，并与位于肉芽肿内部的mcherry标记的H37Ra杆菌结合，表明BBTD@PM NPs具有双重靶向能力。
全面评估了BBTD@PM NPs在体内的治疗效果。在H37Ra感染第21天肺部形成特征性肉芽肿后，给TB小鼠静脉注射PBS、BBTD@RBC NPs、BBTD@M NPs、BBTD@PM NPs或4种一线抗生素联合使用。为了引起光热效应，在注射24 h后，从胸腔外对TB小鼠的整个胸部区域进行1064 nm照射30 min。值得注意的是，与常用的808 nm激光器相比，1064 nm的辐照提供了更深的组织穿透37，并且在穿透6 mm厚的猪肉组织后有效地激发了BBTD@PM NPs的光热效应。不同处理后第14天处死小鼠，采集肺组织进行菌落形成试验。除抗生素治疗组外，未经1064 nm照射的其他治疗组均未引起肺组织中H37Ra的cfu降低，表明这些NPs对结核分枝杆菌没有毒性。在1064 nm照射下，BBTD@PM NPs的杀菌能力显著高于其他处理，甚至大大高于一线抗生素的联合杀菌能力。然后，我们研究了BBTD@PM NPs在1064 nm照射下的总体抗炎和组织修复效果。血红素和伊红(H&E)染色显示，与其他组相比，BBTD@PM NPs和1,064 nm照射治疗显著减轻了肺部弥漫性炎症(大量白细胞浸润)和组织坏死(肺泡壁增厚、纤维化和出血)。同样，肺组织TNF-α和IFN-γ免疫组化染色显示，BBTD@PM NPs组和1064 nm辐照组的抗炎作用最强，甚至高于联合抗生素组。此外，不同处理后肺组织中促炎细胞因子的表达模式也表现出类似的趋势。总之，静脉注射的组合BBTD@PM在1064 nm激光照射胸部区域的NPs可以高精度地治疗结核病，因此具有很大的临床转化潜力。
结论
我们制备了可在1064 nm激发的预激活巨噬细胞样BNPs，用于TB的精确诊断和治疗。这些NPs具有病变和病原体双重靶向能力，超长波长吸收，NIR-IIb荧光发射电位和显著的光热性能。因此，它们可以实现肺原位肉芽肿的高分辨率NIR-IIb成像，对结核分枝杆菌具有光热杀伤作用，具有肺组织修复功效，并具有抗炎活性。这种双重靶向和NIR-IIb成像引导的精确光热模式可能为制定临床环境中结核病管理的可行策略提供见解。
参考文献
Photothermal therapy of tuberculosis using targeting pre-activated macrophage membrane-coated nanoparticles，Bin Li , Wei Wang, Lu Zhao, Yunxia Wu, Xiaoxue Li , Dingyuan Yan , Qiuxia Gao , Yan Yan , Jie Zhang , Yi Feng , Judun Zheng , Bowen Shu , Jiamei Wang , Huanhuan Wang , Lingjie He , Yunlong Zhang， Mingliang Pan , Dong Wang , Ben Zhong Tang & Yuhui Liao ，Nat. Nanotechnol.,https://doi.org/10.1038/s41565-024-01618-0
