内容提要
本文报道了名为AFlavs的NIR-II染料设计，通过黄酮和聚亚甲基支架的框架整合设计。这些不对称分子表现出高亮度、优异光稳定性和强抗猝灭性，使其成为先进生物成像的理想选择。AFlav-4在血管成像中的性能突出，包括肿瘤脉管系统破坏、缺血再灌注评估和通过纳米颗粒的骨靶向递送。AFlavs通过超过100 nm的吸收分离实现了两色、三色和四色多重成像，实现已有小分子NIR-II荧光团中罕见的光谱正交性。
实验结果与讨论
Flav7和SRHCYs都有亚甲基单元，亚甲基通过共轭长度调控花菁荧光团光物理性质。这种分子兼容性促进了自发的发色/芳香体系的异质杂化，通过多亚甲基主干的无中断融合产生一系列命名为AFlav-3-5的新型染料。多色成像通过复杂系统的光谱解耦实现同时多尺度分析，从而彻底改变了生物学研究。当使用NIR-II荧光团时，这种模式的光子优势表现为厘米级组织穿透力、高空间分辨率和实时血流动力学监测。基于黄烊盐衍生荧光团在NIR-II多重分析中的突破性进展，本文还致力于开发一种优化的染料系列，用于血管系统和血管的多通道可视化。多色成像将不同的生物靶标与发射独特、非重叠波长的探针配对。为了在NIR-II范围内利用各种荧光团产生分离良好的正交信号，荧光团应具有近红外吸收和NIR-II发射特性，其长波长发射尾应延伸至NIR-II，且具有高整体亮度，来补偿收集的少量发射信号。不同荧光团之间吸收光谱的分离是控制串扰的主要因素，这直接影响成像特异性。AFlav-3−5的光物理性质可通过亚甲基单元的数量预测，本文将二甲基氨基萘作为额外的供体，在空间上分离吸收波长，这种特定的供体有助于获得具有异常大斯托克斯位移的NIR-II染料。
随着供体取代和共轭双键的延伸，AFlavs的吸收（675−1038 nm）和发射最大值（864−1088 nm）均出现渐进红移。上述红移通过最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道能隙的有效减小得到证实。值得注意的是，AFlav-2-5的吸收波长相差超过100 nm。这种激发正交性，结合尖锐、清晰的发射轮廓，使AFlavs适用于多色NIR-II成像，且具有高信号保真度和最小通道重叠。AFlav-1（188 nm）和AFlav-2（179 nm）的异常斯托克斯位移有利于减少自吸收并提高荧光成像应用中的信号清晰度。尽管AFlav-3至AFlav-5显示出较窄的斯托克斯位移，但它们仍然显著大于已报道的黄酮离子衍生染料（约20 nm）。AFlav-2和AFlav-4均具有2个亚甲基单元，表现出相同的发射最大值，但吸收分离达200 nm。这直接证明供体工程能有效调节基态和激发态构型。它们的相对量子产率范围为0.34-1.47 %。且MEC约为50000-160000 M-1 cm-1，与SRHCYs相比有很大提升。这两个参数协同作用，使AFlavs的亮度值在227-2396 M-1 cm-1之间。光谱正交性和亮度指标共同使该系列分子用于多重血管成像，且信号重叠最小。
为评估AFlavs和参考荧光团（Flav7和IR26）的体内适用性，对其溶剂响应性进行了系统研究。这些化合物的溶剂极性依赖性表现出不同的行为。AFlav-1-2对溶剂极性的敏感性最低，在各种溶剂中保持稳定的吸收峰。相比之下，Flav7和IR26表现出明显的溶剂致变色诱导淬灭，在极性溶剂（如DMSO）中出现宽而弱的吸收峰。随着双键共轭的延长，Flav3-5的抗淬灭效应逐渐减弱，这证实了先前的研究，即过多的聚亚甲基单元与溶剂致变色密切相关。聚集研究进一步凸显了其稳健性。Flav7和 IR26在含水量为50 %时表现出显著的聚集诱导蓝移和近乎完全的峰损失，而AFlav-1和AFlav-2则保留了光谱形状，仅损失约20-30 %。AFlav-3至AFlav-5显示中等的聚集效应，但表现优于花菁类似物。光稳定性测试表明，所有AFlavs在长时间照射下都具有高抗光漂白性，而ICG则迅速失去荧光。
为评估AFlav-4的NIR-II荧光成像在血管和淋巴管可视化中的性能，对小鼠进行了多方位成像。首先，将AFlav-4负载于胶束上用于体内应用。背部、腹部和侧面视图显示了详细的血管网络，且背景干扰最小，而肠系膜成像则显示出精细的血管结构。通过小鼠四足脚垫皮下注射，淋巴管和淋巴结以高对比度清晰可视化。荧光强度分布的定量分析得出半峰全宽值约为226.2-577.5 μm，证实了该成像平台的高空间分辨率。使用1000至1300 nm的长通滤光片进行成像表明，在较长波长下，信噪比（SNR）和血管清晰度逐渐提高。在静脉注射造影剂后立即进行的动态成像，实时捕捉了小鼠脑部通过完整头皮和颅骨的血管灌注动力学，无需开颅。后肢密集且异常的微血管以及肿瘤相关脉管系统均清晰可见，突显了该技术对异常血管结构的敏感性。
选择血管相关疾病作为AFlav-4的新应用模型。Combretastatin A4 phosphate（CA4P）可选择性破坏肿瘤血流来诱导饥饿，迅速瓦解肿瘤血管系统引发破坏性级联反应和广泛肿瘤坏死。为监测血管破坏剂诱导的肿瘤血管破坏，在在给予CA4P前后对4T1荷瘤小鼠分别进行NIR-II荧光实时成像。治疗前，多帧NIR-II成像显示血管网络稳定，荧光信号随时间持续存在，表明血流灌注完好。特别是肿瘤部位充满了衍生的微血管。相比之下，CA4P治疗后，同一肿瘤位置的NIR-II成像几乎检测不到毛细血管结构，仅能清晰捕捉到少数较大的血管。尽管治疗前后的确切成像位置无法完美对齐，但半定量三维荧光-时间分析清楚地显示出荧光信号的显著差异，证实肿瘤毛细血管已被CA4P完全破坏。
在进行肢体挽救手术后，动态监测缺血再灌注对于评估组织恢复和手术疗效至关重要。本文在小鼠后肢缺血模型中进行了实时NIR-II荧光成像。将ICR小鼠仰卧，剃去后肢毛发，然后暂时通过止血夹夹闭右后肢，1、4、8或12小时诱导缺血，随后立即松开夹子并对血流恢复情况进行动态成像。同时监测健康的左后肢以评估缺血再灌注情况。在双侧后肢上选取用黄色圆圈标记的前部、中部和末端三个区域（ROIs），以监测和评估缺血再灌注过程中的动态变化。在缺血1小时组中，几分钟内观察到快速且相对完全的血管再灌注。更长时间的缺血导致再灌注逐渐延迟且不完全，尤其是在肢体远端区域，恢复受损尤为明显。定量荧光-时间图证实，随着缺血持续时间增加，再灌注动力学显著降低。不同肢体区域灌注异质性的实时可视化显示，长时间缺血不仅延迟血流恢复，还导致空间选择性血管缺陷，证明了NIR-II成像在动态、无创监测缺血再灌注损伤中的实用性，并为缺血损伤后血管恢复的时间和空间特征提供见解。
在多色NIR-II成像中避免信号串扰对于实现不同生物靶点的高保真、多重可视化至关重要。当一种荧光团的信号渗入另一种荧光团的检测通道时，就会发生串扰，从而导致误判。使用具有良好分离发射峰的明亮荧光团可能会导致荧光团亮度和发射尾的不平衡，其中高发射染料可能会压制较暗探针的信号，这种情况通常难以预测。使用具有不同激发波段的荧光团仍然是从源头消除串扰的有效方法。幸运的是，AFlav-2-5的吸收峰分离超过100 nm，实现了具有最小交叉的选择性激发。为了验证AFlavs在多色NIR-II成像中的实际应用价值，本文选择激发最大值高度分离（分别为660和1064 nm）的AFlav-2和AFlav-5，在活体小鼠模型中进行双色成像。吸收光谱清楚显示这些染料的显著分离，AFlav-2在NIR-I/NIR-II边界处有吸收，而AFlav-5则很好地延伸到近红外二区区域。激发选择性测试证实，每种染料都可以被独立激发，以最小交叉激活。AFlav-2在660 nm处荧光强度比为9.6:1，AFlav-5在1064 nm处荧光强度比为1:23.6，这反映出优异的光谱正交性，显著降低了信号串扰的风险。利用AFlav-2（红色通道）和AFlav-5（蓝色通道）通过不同注射途径，实现了对多种生物结构的同时且高特异性可视化，几乎无光谱重叠。这种成像方法提供了全面的解剖学和功能学见解：在侧视图中中，淋巴系统和胃部均清晰可见，突出分辨不同组织类型的能力。腹部成像能够精确绘制脉管系统和淋巴网络，而背部成像可有效追踪背部的血管和淋巴系统。在腹部区域，脉管系统和肠蠕动均被动态可视化，展示了该系统实时运动追踪的能力。此外，肠系膜和肠壁的动态成像显示出快速血液灌注以及血管与肠道结构之间明显的互补空间分布模式。定量荧光强度曲线证实了成像结果，在测试条件下显示出分离良好的信号峰且通道间重叠可忽略不计，证实了双通道成像系统的高特异性、灵敏度和无串扰性能。
结论
本文提出一类通过黄酮盐和SRHCY骨架的框架整合的小分子NIR-II荧光团AFlavs。这种设计将黄酮盐染料的亮度/模块化与聚亚甲基系统的光谱范围/可调性相结合，产生了具有可调光学特性、大斯托克斯位移（40-189 nm）和相对于SRHCY类似物更高亮度（227-2396 M-1 cm-1）的紧凑型发光体。在该系列中，AFlav-4因其在生物相关介质中的平衡性能和稳定性，成为体内成像的实用先导化合物。利用AFlav-4，我们实现了深层组织、实时血管和淋巴映射以及相关疾病诊断。骨靶向纳米颗粒进一步实现了高对比度的骨骼成像。AFlav-2至AFlav-5的吸收最大值分离>100 nm，在测试条件下能够实现激发正交的双色、三色和四色成像，并具有清晰的通道隔离。
参考文献
Framework Integration Engineered Asymmetric Cyanine Dyes for In Vivo High-Performance NIR-II Imaging and Multiplexed Labeling, Yufei Qin, Jiaming Guo, Yujie Qin, Zihan Xu, Mingxi Fang, Hualong Fu, Mengchao Cui, and Kaixiang Zhou, Anal. Chem. 2025. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c04745
