内容提要
该研究设计并合成了可调节代数的聚（L - 赖氨酸）树枝状大分子（Cy-NIR II-Gx），其核心为共价整合的亲水性近红外二区（NIR-II，1000-1700 nm）花青染料（Cy-NIR-II-NH₂）。树枝状结构有效抑制 H 聚集并隔绝荧光团与水相的淬灭作用，使量子产率提升24.3 倍（水中最高达 0.802%），48 小时光照后光稳定性保留率>83%；其中 Cy-NIR-II-G8 表现最优，在组织模拟体模中穿透深度达6 mm，经皮内或静脉给药后对 4T1 乳腺癌移植瘤的肿瘤 - 正常组织比（T/NT）>5，持续 7 天，可实现清晰的术中肿瘤边界勾勒，术后信号完全消除，同时具备良好生物安全性，为深部成像与精准手术提供了高效 NIR-II 荧光探针。
NIR-II花菁染料(Cy-NIR-II-NH2)的合理设计、合成及表征
该染料具有增强水溶性和通过伯胺基团易于功能化的特性。构建了具有精确分子结构的可调谐聚l -赖氨酸树状大分子(Cy-NIR-II-Gx)。通过精确生成控制(G0-G8)，该结构有效抑制了Cy-NIR-II-NH2在水介质中的h聚集，并通过刚性隔离显著降低了水分子碰撞引起的非辐射松弛树突壳的效果，从而同时提高溶解度、荧光亮度和光稳定性。设计了一种亲水性NIR-II菁染料，其电子供体支架由2-甲基苯并[cd]吲哚衍生物和聚甲基桥构成。以高收率的苯并[cd]吲哚-2(1H)- 1为原料，以格氏加成和Knoevenagel缩合为关键步骤构建核心结构。这也是一个具有挑战性的过程，因为在这些反应条件下，核心和末端官能团容易被分解。这种方法成功地安装了两个伯胺基团，提高了水溶解度，并允许通过胺反应性连接剂偶联。Cy-NIR-II-NH2在980 nm激光激发下，最大吸收≈990 nm(摩尔吸收系数为1.36 ×10-5 M−1 cm−1)，最大发射波长为1044 nm，宽发射跨度(1000 ~ 1350 nm)延伸到DMSO中的NIR-IIa区域(1300 ~ 1400 nm)。此外，虽然大多数NIR-II染料水溶性差，限制了直接的生物效用，但[25]Cy-NIR-II-NH2具有与临床批准的ICG相当的溶解度，并且优于商业NIR-II多甲基花菁染料(IR-26和IR-1048)，同时保持强吸收特性。值得注意的是，其水溶液在800 nm处表现出强烈的吸收，这归因于疏水苯并[cd]吲哚-聚甲基支架通过正面堆叠形成h聚集体，这是平面菁染料在水介质中的行为特征为了进一步阐明原子排列对化学结构相似的Cy-NIR-II-NH2和ICG光物理性质的影响，我们在B3LYP/6-31+G(d)水平上进行了TDDFT计算。NIR-II-NH2和ICG的苯环原子都参与HOMO轨道，导致相似的能级。不同的是，ICG的LUMO仅少量分布在苯并[e]吲哚环上，而NIR-II-NH2的LUMO分散分布在整个共轭链上，导致LUMO水平显著降低。与ICG相比，Cy-NIR-II-NH2较低的辐射衰减率导致其荧光量子产率(QY)降低。然而，理论计算证实，这两种染料中的S1激发主要来自HOMO到LUMO的转变。因此，在LUMO主要分布的共轭多甲基链周围设计一个孤立的微环境，可以有效地防止分子间与水的相互作用，减少非辐射能量转移，并在水中提供高的荧光QY以IR-26(在二氯乙烷中为0.05%)为参比标准，测定Cy-NIR-II-NH2的荧光QY为0.033%。
Cy-NIR-II树状大分子的制备及光物理性质
为了将可定制的NIR-II发射、精确控制的结构、单分散的纳米级尺寸、高荧光亮度、增强的光稳定性和多功能表面基团集成到单一试剂中，我们通过发散方法合成了具有Cy-NIR-II-NH2核(Cy-NIR-II-Gx)的聚l -赖氨酸(PLL)树状大分子，协同解决先进生物医学应用的关键要求。Cy-NIR-II-NH2与Boc保护的赖氨酸五氟苯基酯反应形成第一代树状前体，随后Boc脱保护生成Cy-NIR-II-G1。赖氨酸偶联(Boc- lys (Boc)-OPFP)和去保护的迭代循环产生了更高代的树状大分子(Cy-NIR-II-Gx)，最终形成了第8代结构体Cy-NIR-II-G8。所有树状大分子结构均通过HRMS/MALDI-TOF-MS和NMR谱进行了严格的表征，实验结果与理论预测非常吻合，验证了每一代的结构完整性。此外，HPLC分析显示，所有树突分子世代都有一个单一的尖峰，证明了卓越的合成纯度和结构同质性。保留时间随着代数的增加而系统性地减少(G0: 18.5 min→G8: 10.4 min)，这是由于累积的表面氨基增强了分子极性。这种单模洗脱谱证实了不存在结构缺陷或不完整的反应副产物——这对可重复的生物医学性能至关重要。凝胶渗透色谱(GPC)进一步验证了单分散性和精确的分子结构:保留时间随着高代而减少(G4: 16.5 min→G8:14.3 min)，与分子量增加引起的水动力半径扩张一致，而多分散性指数(PDI, 1.030-1.078)证实了均匀的分子量分布。Cy-NIR-II- G8的透射电镜(TEM)显示单分散的球形纳米颗粒，平均直径为14.4±0.4 nm随着代数的增加，荧光发射强度逐渐增加， QY从0.033% (G0)增加到0.802% (G8)，增加了24.3倍。该QY值显著高于参考染料，如IR-26和其他水溶性NIR-II染料(如CH-1055-PEG)在NIR-II成像下，水溶液中的亮度增强直观地证实了荧光相关增强，与定量光谱趋势一致。
高光稳定性是生物医学应用中对荧光团的基本需求，特别是在长期荧光跟踪和图像引导手术中花青素染料芯的聚甲基桥在照明下容易受到O2介导的氧化裂解，导致光漂白，限制了生物效用，树状聚合物嵌入荧光团中的PLL封装充当空间屏蔽，防止染料核与单线态氧之间的直接相互作用，从而增强光稳定性。在连续短时间激光照射下成像，Cy-NIR-II-G8水溶液保持稳定的荧光强度和成像亮度，与ICG相比性能有所提高。
血管的体内实时成像
对Cy-NIR-II-G8介导的血管体内实时成像可从成像动态过程、空间分辨率、对比优势三个维度进行详细总结：速且完整的全身血管动态映射，时间序列成像显示，BALB/c裸鼠经静脉注射乙酰化Cy-NIR-II-G8（核心染料剂量0.6 mg/kg，20 nmol）后，染料在体内实现了快速的系统性分布：5 s内即可在尾静脉观察到强烈荧光信号；10 s时染料经静脉回流至心脏腔室；15 s时已能清晰显影颈动脉等动脉血管，同时伴随部分肝脏蓄积；1 min内便完成了全身体表及深部血管的完整映射，其动态分布过程完全契合临床快速诊断成像的时间需求。
高空间分辨率的局部血管成像，对脑、颈部、腹部、后肢四个关键解剖部位的局部放大成像与截面荧光强度分析显示，Cy-NIR-II-G8的血管成像具备显著的分辨率优势：通过高斯拟合血管截面荧光强度曲线，其信号背景比（SBR）可达1.27-1.81，半峰全宽（FWHM）仅为0.367-0.664 mm；即便是颅骨等厚组织覆盖的脑部血管，也能实现清晰显影，突破了传统成像剂在厚组织区域的分辨率局限。
相较于ICG的核心性能优势，与临床常用的ICG（0.8 mg/kg，20 nmol）相比，Cy-NIR-II-G8的血管成像优势体现在两方面：一是成像持久性，其血管内信号可稳定维持超1小时，而ICG因快速的肝脏清除作用，血管信号衰减较快；二是成像清晰度，ICG的局部血管SBR仅为1.12-1.51，FWHM达0.606-0.847 mm，在脑部等厚组织区域甚至无法分辨血管轮廓，而Cy-NIR-II-G8凭借NIR-II窗口的低散射特性、高量子产率及稳定的循环动力学，实现了全解剖部位的高对比度血管显影。
体内淋巴成像
在荷 4T1 皮下移植瘤的 BALB/c 裸鼠后肢，通过双侧后爪皮内注射 Cy-NIR-II-G8（核心染料剂量 0.6 mg/kg，20 nmol），聚焦 “淋巴引流 - 肿瘤关联” 双场景 —— 既追踪淋巴系统的生理引流路径（爪部→坐骨淋巴结→腘窝淋巴结），又监测染料向肿瘤区域的靶向聚集，契合临床 “前哨淋巴结定位 + 肿瘤转移排查” 的双重需求。注射后 2 h 内，Cy-NIR-II-G8 即可被毛细淋巴管吸收并随淋巴液流动，清晰显影收集淋巴管主干、坐骨淋巴结及腘窝淋巴结，且信号无明显背景干扰 —— 这得益于树枝状结构抑制 H 聚集、提升量子产率（G8 达 0.802%），避免了传统染料（如 ICG）因光漂白或背景荧光导致的淋巴结构模糊。随时间推移（8~72 h），淋巴结处的 Cy-NIR-II-G8 信号逐渐衰减，而肿瘤区域信号持续增强，48 h 达峰值并维持至 72 h—— 这一现象源于树枝状大分子的EPR 效应（增强渗透滞留效应） 与肿瘤细胞对其的选择性摄取，证明其不仅能显影淋巴结构，还可实现 “淋巴引流 - 肿瘤聚集” 的联动监测，为判断肿瘤淋巴转移风险提供依据。通过对淋巴血管横截面荧光强度的高斯拟合分析，Cy-NIR-II-G8 展现显著优势： Cy-NIR-II-G8 的 SBR 达 1.41，而 ICG 仅为 1.18——NIR-II 窗口（1000~1350 nm）的低组织散射特性，结合树枝状外壳隔绝水相淬灭，使淋巴信号在深层组织中仍能有效区分于背景； Cy-NIR-II-G8 的淋巴血管 FWHM 为 0.361 mm，远小于 ICG 的 0.619 mm—— 意味着其能更精准勾勒淋巴管边界，甚至显影 ICG 无法分辨的细小分支淋巴管，匹配临床 “前哨淋巴结精准定位” 的手术需求。
结论
我们通过共价整合NIR-II花青素染料(Cy-NIR-II-NH2)作为聚l -赖氨酸树状大分子(Cy-NIR-II-Gx)的核心支架，开创了一种树状大分子结构。这种设计保留了菁染料固有的NIR-II光学性质，同时将荧光团从水环境中分离出来，确保胶体稳定性并最大限度地减少环境干扰。世代依赖的生长赋予可编程光物理:树突接枝增强了分子的分散能力，而空间屏蔽破坏了h聚集(红移吸收到960 nm)，协同放大了荧光量子产率24.3倍(在水中为0.802%)，具有出色的光稳定性(48小时照射后信号保留率为>83%)。优化后的Cy-NIR-II-G8结合了NIR-II发射和优越的肿瘤积累特异性，实现了深层组织穿透能力(幻象6mm, ICG深度加倍)和低于0.4 mm的血管分辨率，实现了多功能生物成像:实时跟踪血流动力学，高对比淋巴造影术，纵向肿瘤监测持续肿瘤特异性积累(T/NT bbb5 7天)。它符合精确肿瘤切除的临床导航标准(Rose标准，SBR = 5)，通过明确的边界划定和切除后肿瘤信号的几乎完全消除(T/NT≈1.13)进行验证。此外，可编程树突状拓扑结构的特点是尺寸可调和丰富的表面氨基，可以实现定制的细胞内化，同时提供多功能的偶联位点，用于整合靶向部分(例如抗体、肽)，以推进图像引导干预。通过将NIR-II花青素光子学与树突状纳米技术相结合。
参考文献
Dendritic NIR-II Cyanines Enable Deep Imaging and Precise Surgery ，Bo He, Zhehao Wang, Yuji Sun, Ying Piao, Chengyuan Dong,* Youqing Shen, and Zhuxian Zhou*，Small 2025, e09826，https://doi.org/10.1002/smll.202509826.
