内容提要
阐明光动力疗法（PDT）的光化学作用机制（MoA）可能会提高其疗效，并为开发新的PDT光敏剂奠定基础。在这里，我们提供的证据表明，“光氧化还原催化细胞”，其中关键的电子传递途径被破坏，可以构成一个一般的MoA与PDT。以细胞电子供体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为例，我们发现，众所周知的光敏剂，如玫瑰红，BODIPY，吩硒嗪，酞菁，卟啉衍生物，能够催化其转化为NAD+。这种MoA与传统的I型和II型光活化机制，涉及电子和能量转移。设计了一种新设计的分子靶向光催化剂（称为CatER）来测试这种基于机制的方法在光敏剂开发中的实用性。CatER的光激发通过caspase 3/GSDME途径诱导细胞焦亡。特异性表皮生长因子受体阳性癌细胞识别、高信号背景比肿瘤成像（SBRTI = 12.2）和良好的肿瘤生长抑制（TGI = 77.1%）都是CatER的标志。因此，CatER构成了有效的近红外热凋亡细胞死亡光诱导剂。我们相信，目前的结果将提供基础，尚未改进的光疗剂，将光催化化学到其分子设计的合成。
结果与讨论
受Huang等人上述报告的启发，探索已知的PS基序是否会作为生物相关转化的光催化剂。我们选择NADH（180 μM）作为本研究的底物，因为它的普遍性和重要性。然后，我们选择了几种已知的PS，包括玫瑰红、BODIPY、吩硒嗪（Se-NH 2）、血卟啉（HMME）、酞菁（ZnPc）和卟啉衍生物（Por Ph-NH 2）。在光照射条件下，在存在这些代表性PS（5 μM）的情况下，NADH被耗尽并转化为NAD+，尽管效率不同，这通过339 nm处的吸光度快速下降（NADH的光谱特征）以及沿着的260 nm处的吸光度增加（NAD+的光谱特征）（21）进行了验证。这些发现使我们考虑光氧化还原催化可能在PDT中发挥作用。为了测试该MoA是否与生命系统相关，我们优化了BODIPY支架以获得NIR MTcat系统（即，CatER）。CATER是一个包含ER和BODIPY型PS的两组分体系。ER是FDA批准的酪氨酸激酶抑制剂，已被广泛用于靶向和抑制EGFR(化学缩写列表见图1)，EGFR在多种肿瘤中过度表达，包括肺癌、卵巢癌、头颈癌。因此，内质网的存在有望为CATER提供理想的靶向和增强的细胞毒性。制备了没有ER部分的母体分子BDP作为对照。详细的合成路线见SIAppendex。所有化合物均经1H核磁共振和13CNMR波谱、ESI-HRMS和高效液相色谱法(SI附录)确证。紫外-可见光谱(UV-Vis)研究表明，CATER和BDP在6 0 0-70 0 nm(ε=65,042 M1×cm 1)和BDP光谱范围内表现出典型的类Q带吸收.在660 nm激发下，观察到在650-900nm的“生物窗口”内有集中在702 nm处的强近红外荧光发射。测得CATER的绝对荧光量子产率为0.06。纳秒瞬时吸收(ns-TA)差分光谱研究表明，CATER可以很容易地发生系统间交叉(ISC)，形成相应的激发三重态(T1；即3[CATER]*)。CATER的暂态特征与BDP的暂态特征吻合得很好(SIAppendex)。在此基础上，我们得出结论，CATER的T1状态是由BDP部分而不是ER亚基控制的。
与我们以前的工作一致，光激发CATER被发现有效地产生1O2。因此，预计CATER可以通过传统的II型MOA起到PDT光敏剂的作用。然而，本研究的一个主要目的是确定CATER是否也将作为一台个人计算机，能够促进将NADH转换为NAD+。如图2F所示，在光照射条件下(35 S，660 nm激光，100 mW/cm~2)，UV-Vis光谱研究表明，在CATER(5μM)的存在下，NADH(在二甲基亚砜中为180μM)被转化为NAD+。图ln(Abs.在339 nm处)与照射时间符合一级反应动力学。重要的是，使用NaN3作为1O2清除剂的1O2猝灭研究当量。相对于CATER显示在其他相同条件下NADH消耗率几乎没有明显变化。这证明了Cater介导的光氧化还原催化是NADH光氧化的主要机制。CATER NADH光催化的最大翻转数(TON)和翻转频率(TOF值)分别为28.75min-1和49.3min-1；这些值(按计算为3到100倍)高于常见的过渡金属络合物和纳米材料基PC。在光氧化还原NADH催化的情况下，激发的NADH*和三重态3[PC]*之间的设定过程被认为是NADH/NAD+转化的速率决定步骤。因此，我们认为3[CATER]*(τ=0.84μSiN_2)相对较长的激发态寿命可能会助长这一过程。良好的空间相互作用也可能是导致TON和TOF值较高的原因。从图可以看出，密度泛函理论计算表明，在NADH和CATER之间形成了一个相对稳定的“被钳制”的络合物。因此，我们建议相应的激发三重态3[cater]*位于NADH电子给体位置附近，允许在光激发条件下进行电子转移。通常，中间形式的催化剂需要转化回其初始活性形式以完成催化循环。在推定的光催化剂CatER的情况下，从NADH提取的电子需要转移到电子受体（氧化剂）。在这项研究中，溶解O2预计将履行这一关键功能。为了证实这一点，我们在脱氧条件下测试了CatER的光催化性能。与在空气饱和条件下看到的平滑的NADH/NAD+转化相反，当使用N2将DMSO NADH溶液脱气时，几乎没有看到NAD+产生，计算的TOF仅为3.8min-1。在此基础上，我们得出结论，O2是必要的，以完成催化循环。考虑到先前的工作，因此提出了在CatER存在下，通过SET操作的O2依赖性还原淬灭循环用于NADH向NAD+的光诱导转化。
我们接下来研究了使用A549（人肺泡腺癌）细胞的细胞培养中光氧化还原机制范例的影响（如果有的话）。根据我们的设计预期，观察到NADH的光剂量依赖性消耗。具体地，对于CatER处理的细胞，观察到照射5分钟后减少23%，照射15分钟后减少40%。然而，即使在孵育长达24小时后，在黑暗中用CatER处理对细胞NADH水平的影响也可以忽略不计。如上所述，NADH和NAD+不仅是在细胞质中发现的关键辅因子，而且还参与与细胞代谢相关的许多途径，包括线粒体电子传递链（mito-ETC）和糖酵解。因此，我们推测光氧化还原催化引起的NADH/NAD+失衡将导致细胞功能和细胞代谢过程的显著变化。与该假设一致，发现当用CatER结合光照射（660 nm，100 mW/cm2）处理A549细胞时，观察到细胞线粒体膜电位（MMP）的去极化，表明线粒体功能完整性的丧失。这一假说的进一步支持来自于以下观察结果：甲瓒形成（一种需要NADH作为辅助因子的细胞氧化还原反应）被阻断。然后使用标准水溶性四唑盐（WST-8）测定进行细胞活力研究。在光照（660 nm，100 mW/cm 2，5 min）后，CatER和BDP（但不是ER）均在A549细胞中以剂量依赖性方式表现出高水平的抗增殖活性。计算得出CatER和BDP的半数最大抑制浓度（IC 50）分别约为0.4和0.7 μM。这些光细胞毒性与临床可用的PS竞争，例如，血卟啉衍生物HMME（IC 50>4.8 μM）。使用AM/PI双染色试剂盒的活/死细胞的共聚焦成像为CatER的推断的光疗效力提供了进一步的支持。在A549细胞中观察到CatER的光敏诱导ROS生成。为了解析ROS生成与光氧化还原催化的影响，在大量过量NAC [N-乙酰基-L-半胱氨酸，ROS清除剂（30）]的存在下进行了类似的研究。在这些条件下，仍观察到明显的细胞死亡（>43%，而在不存在NAC的情况下为约70%）。这被认为是对核心论点的支持，即光氧化还原催化至少部分地有助于CatER的总体PDT效应，并推断其他PDT PS。用CatER观察到选择性EGFR+癌细胞识别和渗透性。例如，在孵育后24小时，EGFR+A549细胞中归因于CatER的细胞荧光强度分别比EGFR-L02（正常人肝细胞）和HLF（正常人肺成纤维细胞）细胞中的细胞荧光强度高约8倍和29倍。然而，当用EGFR抑制剂预处理A549细胞时（即，ER），CatER的总体细胞摄取以统计学显著的方式受到抑制。这支持了以下推断：观察到的选择性是活性EGFR靶向的直接结果。使用CatER结合光照射也实现了EGFR+癌细胞的选择性消融。相比之下，对于BDP（缺乏ER靶向部分的对照），没有观察到这种有益的结果。基于分子对接研究，我们提出CatER有效地对接到EGFR酪氨酸激酶（PDB：1 M17）的天然疏水口袋中。这种对接似乎是有利的。结合自由能计算为约8.2 kcal/mol。认为CatER骨架和EGFR-TK结构域之间的相互作用，包括疏水性（残基：Leu 694、Phe 699、Val 702、Lys 721、Leu 820、Pro 853和Lys 889）和π-π供体-受体效应（残基：Trp 856），提供了结合的驱动力。与游离ER（掺入CatER的EGFR抑制剂亚基）相比，在CatER情况下，在残基Lys 855处观察到额外的氢键（注意，两种系统均提供了两个氢键，分别与残基Lys 721和Thr 766形成氢键）。总的来说，这些结果为在CatER病例中观察到的有效EGFR靶向提供了依据。
在探索细胞死亡机制时，我们发现CatER PDT触发gasdermin E（GSDME，一种成孔蛋白）介导的细胞凋亡，这是一种裂解和促炎形式的程序性细胞死亡，与常规细胞凋亡和坏死不同（19，20）。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显示A549细胞在CatER PDT后的形态学变化与焦亡一致。具体地，在用0.5 μM CatER培养并进行光照射后，（660 nm，100 mW/cm 2，5 min）细胞明显肿胀，核中央定位，以及称为热变性体（31）的气泡状突起形成（如通过用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）缀合物的绿色荧光染色，白色箭头所示）。Hoechst 33342染色（蓝色荧光）显示，A549细胞的细胞核在CatER PDT后保持完整，而不是经历碎片化;这与凋亡相比是形态学上的明显差异。
对CatER PDT诱导细胞焦亡的进一步支持来自通过A549细胞中的蛋白质印迹分析测量的N-末端成孔结构域GSDME-N活化的研究。在暴露于CatER并进行光照射（660 nm，100 mW/cm 2，5 min）后，切割的半胱天冬酶-3和切割的GSDME的表达水平（即，GSDME-N）增加。这些观察结果与先前的报道一致，即裂解的半胱天冬酶-3可直接促进GSDME的裂解。还观察到细胞内乳酸脱氢酶（LDH）（S100 dix）和促炎细胞因子白细胞介素（IL）-1β的释放，这是焦亡的两个标志。然而，在其他相同条件下，未观察到BDP的明显焦亡激活。我们将这一结果归因于这样一个事实，即该控制系统缺乏ER亚基存在于CatER。这限制了细胞摄取并导致低水平的细胞内NADH/NAD+转化（S100 dix）。BDP的细胞ROS生成水平相对较低也可能导致这种差异。在没有光照射的情况下，没有细胞表现出焦萎效应。另一方面，在与触发焦亡相同的条件下，在CatER介导的PDT的情况下，未观察到细胞凋亡或铁凋亡的证据。采取一致行动，这些结果支持的命题，CatER的行为，以诱导在光照射条件下的焦亡。因此，我们建议，它，或其他光氧化还原催化剂系统可以找到应用程序作为光控pyroposis-inducing剂。
作为对CatER作为潜在抗癌剂的潜力的测试，我们检查了其在携带EGFR+4 T1肿瘤的Balb/c小鼠中延迟肿瘤生长的能力。作为这些研究的前奏，首先使用小动物荧光成像系统探索了CatER的体内行为。与在BDP的情况下所看到的相反，在静脉内（i. v.）尾静脉注射CatER后，可见肿瘤部位“变亮”，因此容易与邻近组织区分。随着时间的推移，观察到肿瘤区域中CatER的NIR荧光信号逐渐增加，在注射后24小时达到最大值。在该时间点，获得了高达12.2的信号背景比（SBR）[SBR值≥2.5被视为优先肿瘤蓄积（34）]。此外，离体成像显示，CatER在大多数器官中迅速排泄，但优先保留在肿瘤组织中>36小时，如通过荧光成像所确定的。相比之下，对照BDP（SBR：1.68）未观察到明显的肿瘤蓄积和SI附录），这一发现归因于其缺乏对EGFR的特异性识别。在初始治疗后16天，CatER +光组中的肿瘤生长受到抑制，记录到平均肿瘤生长抑制（TGI）为1.77%，而对于BDP +光组，保留了1.50 -60%的肿瘤体积。在不存在光照射的情况下，对于CatER或对于PBS对照，基本上没有观察到肿瘤抑制。使用苏木精/伊红（H&E）染色的肿瘤切片的组织学分析为CatER和光的组合在体内损伤肿瘤细胞的结论提供了进一步的支持。此外，在本治疗研究的过程中，所有小鼠表现正常，没有任何压力或不适的迹象。没有观察到异常的体重减轻，并且在主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）中没有观察到明显的炎症反应。总的来说，这些结果与上文讨论的体外抗增殖研究完全一致，并为CatER代表可用于抑制体内肿瘤生长的有效NIR光催化剂的结论提供支持。
结论
“细胞内光氧化还原催化作用”可能是PDT效应的一个潜在潜在的潜在MoA。常规PS的筛选研究为以下概念提供了支持：它们至少部分地通过充当光氧化还原催化剂和破坏细胞NADH稳态来介导其功能。为了支持这一假设，我们设计并合成了一种近红外分子靶向光催化剂，CatER。在光照射时，发现CatER促进光催化NADH/NAD+转化，同时提供选择性EGFR+癌细胞识别。体外研究显示，CatER与NIR照射协同作用通过半胱天冬酶3/GSDME诱导细胞凋亡。最后，使用小鼠模型证明了体外癌细胞消融和体内肿瘤生长抑制。基于目前的研究结果，我们认为光氧化还原催化可能代表一种可推广的作用机制，对其在PDT中作用的认识可能有助于设计尚未改进的光疗剂。在这方面，CatER似乎在体外诱导焦亡的观察结果值得注意。焦亡已经成为癌症研究的新前沿，在肿瘤免疫治疗方面很有前途。具体来说，我们认为，CatER或其他PS可能有一个作用，通过光诱导的pyroptosis激活刺激肿瘤免疫。我们小组目前正在沿着这些路线开展工作。
参考文献
Photoredox catalysis may be a general mechanism in photodynamic therapy，Mingle Lia, Yunjie Xua, Zhongji Pub, Tao Xiongc, Haiqiao Huang, Saran Long, Subin Sona, Le Yua, Nem Singha, Yunkang Tongc, Jonathan L. Sesslerd , Xiaojun Pengc, and Jong Seung Kima, PNAS, 2022, 119, 34, e2210504119， https://doi.org/10.1073/pnas.2210504119
