内容提要
本文提出了一种新颖的分子设计策略，旨在开发将聚集诱导发射（AIE）活性、线粒体靶向、高效活性氧生成以及高光热转换能力集成于单一分子的卓越光免疫治疗剂。全面研究表明，通过策略性设计的目标分子（TPETTBI）可发挥显著的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）效应，导致肿瘤细胞死亡。PDT 和 PTT 的协同作用可进一步诱导线粒体功能障碍，并触发大规模免疫原性细胞死亡（ICD），从而实现持久的抗肿瘤免疫效应。
结果与讨论
分子设计合成与的光物理性质
强电子供体和受体基团可增强荧光团的吸收和发射特性，而供体 - 受体（D-A）体系的构建则进一步促进活性氧（ROS）的生成。吲哚在初步设计的分子 MTPAI 中，选择 4,4'- 二甲氧基三苯胺作为 AIE 单元和供体单元，通过双键与受体单元连接。为进一步改善 AIE 性质并实现发射波长红移，TPETTI 引入了额外的可旋转单元和扩展的 π 共轭体系。此外，为增强目标分子的吸收能力，引入 1,1,2 - 三甲基 - 1H - 苯并 [e] 吲哚。该修饰可提供最高的 D-A 强度，有望实现最长的发射波长。系统研究了这些化合物的光物理性质。MTPAI、TPETTI 和 TPETTBI 分别在 540 nm、567 nm 和 576 nm 处表现出强烈的吸收。具有扩展 π 共轭结构的 TPETTI 和 TPETTBI 呈现出更长的吸收光谱。这些化合物的发射波长呈现出从 MTPAI 到 TPETTI 再到 TPETTBI 逐渐延长的趋势。这种顺序可归因于 TPETTI 和 TPETTBI 的 π 共轭扩展和 D-A 强度增强。重要的是，TPETTI 和 TPETTBI 的发射光谱延伸至近红外区域，可能为体内成像提供更好的兼容性。随后，在 DMSO/H₂O 混合溶剂中研究了这三种化合物的 AIE 性质。随着水含量的增加，TPETTI 和 TPETTBI 的发射强度均增强，表现出典型的 AIE 特性。为评估整体光诱导 ROS 生成能力，使用 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为指示剂。在光照射下，DCFH 的荧光无明显变化，而在 MTPAI 存在下荧光逐渐增加。对于 TPETTBI，照射后荧光增加并在 10 秒内达到平台期。TPETTI 组表现出类似的变化。这些结果表明 TPETTI 和 TPETTBI 均具有优异的 ROS 生成能力。值得注意的是，TPETTBI 和 TPETTI 的 ROS 生成能力优于商用光敏剂，如玫瑰红（RB）和 Ce6。评估了三种化合物的光热行为。在 660 nm 激光照射 5 分钟后，MTPAI、TPETTI 和 TPETTBI 的温度急剧升高并分别稳定在 40.9°C、59.9°C 和 65.0°C。值得注意的是，TPETTBI 表现出最佳的光热性能，并且在 660 nm 激光（0.4 W・cm⁻²）下经过六个加热 - 冷却循环后温度衰减可忽略不计。因此，NIR-II 发射、优异的 ROS 生成能力、高光热效率和热稳定性使 TPETTBI 成为诊疗应用的有前途候选者。
线粒体靶向成像
在确认 TPETTBI 优异的光物理性质后，我们进一步研究了其在细胞水平的成像能力。使用商用探针，包括 Dio（膜探针）、溶酶体绿色荧光探针（LysTracker Green, LTG）和线粒体绿色荧光探针（Mito-Tracker Green, MTG），探究 TPETTBI 的细胞定位。MTG 的绿色荧光信号与 TPETTBI 的红色荧光信号显著重叠，而 TPETTBI 的红色荧光信号与 LTG 和 Dio 的信号均不重叠。这些结果表明 TPETTBI 具有出色的线粒体靶向能力，这可归因于其两性离子结构。此外，由于线粒体是肿瘤治疗的潜在靶点，TPETTBI 的线粒体靶向能力可能会增强其光疗效率。TPETTBI 能够在 10 分钟内可视化线粒体，并且荧光强度随着孵育时间的延长而逐渐增加。值得注意的是，在整个过程中，背景信号可忽略不计，无需洗涤。即使在连续成像 3 小时后，荧光信号也没有衰减，证明了 TPETTBI 优异的光稳定性。这种超快且免洗的染色能力可归因于 TPETTBI 的两亲性和 AIE 性质。一方面，TPETTBI 的亲脂性部分使其易于被细胞摄取；另一方面，带正电的部分使 TPETTBI 能够聚集在带负电的线粒体中。
体外杀瘤评估
鉴于 TPETTBI 优异的光动力和光热疗效以及出色的线粒体靶向能力，我们进一步评估了其光疗性能。首先，使用 CCK-8 法评估了 TPETTBI 的暗毒性和光毒性。即使与 30μM 的 TPETTBI 孵育，3T3 和 LO2 细胞的存活率仍保持在 90% 以上，表明其暗毒性可忽略且生物相容性良好。照射后，当浓度低至 2μM 时，4T1 肿瘤细胞的存活率降至 40%。使用 DCFH-DA 评估了细胞内 ROS 的生成。与其他处理组相比，在 TPETTBI 和 660nm 激光照射的组中观察到 DCF 强烈的绿色荧光信号，表明细胞内产生了过量的 ROS。随后，进行活 / 死细胞染色以验证 TPETTBI 的光毒性。TPETTBI 和 660nm 激光处理组显示出强烈的红色信号，仅观察到少量绿色信号，而其他组主要显示绿色信号。
细胞免疫原性细胞死亡诱导研究
鉴于 TPETTBI 出色的线粒体靶向能力和治疗效果，我们进一步利用 JC-1 染色实验研究了其对线粒体的影响。JC-1 染料常用于监测线粒体膜电位（MMP）的变化，通常在细胞内以两种形式存在。在 MMP 较高的细胞中，JC-1 发出强烈的红色荧光；，MMP 降低会导致 JC-1 单体形成，荧光从红色转变为绿色，从而指示 MMP 的变化。TPETTBI 与激光联合处理组呈现弱红色荧光和较强的绿色荧光，合并图像中显示为绿色荧光；而其他组主要显示强烈的红色荧光信号。我们还使用 FCM 评估了红 / 绿荧光的比率。TPETTBI 与激光处理组中超过 75% 的细胞发出绿色荧光，这与 JC-1 染色成像结果一致。这些结果表明，PDT 效应引起的氧化应激导致了线粒体功能障碍。已有研究证实，ROS 诱导的线粒体应激可触发大规模 ICD 。鉴于 TPETTBI 强大的 ROS 生成能力、光热效率和出色的线粒体靶向能力，我们进一步评估了其诱导 ICD 的潜力。ICD 诱导通常伴随损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，如三磷酸腺苷（ATP）、高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）和表面暴露的钙网蛋白（ecto-CRT）。因此，首先研究了 ATP 的分泌水平。我们观察到，TPETTBI 与激光处理的 4T1 细胞上清液中 ATP 的浓度显著高于其他三个对照组。进行免疫荧光染色分析不同处理条件下细胞中 HMGB1 和 ecto-CRT 的表达水平。TPETTBI 与激光处理组中几乎观察不到 HMGB1，表明 HMGB1 发生了迁移和释放。在 ecto-CRT 的免疫荧光染色中，TPETTBI 与激光处理组在细胞表面显示出强烈的 ecto-CRT 红色荧光信号，表明有效诱导了 ICD。这些观察结果表明，TPETTBI 可有效促进 DAMPs 的生成和释放，为 PDT 与 PTT 协同作用引起 ICD 提供了典型证据。
体内近红外二区（NIR-II）荧光成像与光热成像
在体外实验取得积极结果后，我们进一步评估了TPETTBI 的体内性能。首先将 TPETTBI 用 DSPE-PEG2000 包裹，制备得到粒径为 147.8 nm、zeta 电位为 - 20.16 mV 的 TPETTBI 纳米颗粒，这些性质表明其在生物环境中具有良好的稳定性。随后在 4T1 乳腺癌荷瘤小鼠模型中首次进行了体内肿瘤成像。在静脉注射 TPETTBI 之前，通过 1050 nm 长通（LP）滤光片观察到小鼠的荧光信号较低，表明背景干扰最小。注射后 6 小时，NIR 相机可捕捉到肿瘤部位的 NIR-II 荧光信号，这表明由于增强的渗透性和滞留（EPR）效应，TPETTBI 成功在肿瘤组织中积累。肿瘤部位的荧光信号逐渐增强，在注射后 12 小时达到最大值，随后由于代谢作用开始衰减。此外，注射后 36 小时对肿瘤组织进行的离体荧光分析证实了 TPETTBI 的有效积累。鉴于 TPETTBI 显示出优异的光热转换能力，我们进一步使用红外热像仪评估了其体内光热效应。在注射后 12 小时，用 660 nm 激光（0.4 W・cm⁻²）照射 8 分钟后，肿瘤部位的温度迅速从 35°C 升高至 49°C。相比之下，用盐水处理的小鼠仅表现出可忽略的温度变化。
体内肿瘤协同光疗
利用 4T1 荷瘤 BALB/c 小鼠模型评估了 TPETTBI 的体内抗肿瘤特性。具体而言，将 4T1 荷瘤小鼠随机分为四组：两组分别接受生理盐水处理（伴或不伴激光照射）的对照组、一组仅接受 TPETTBI 处理的对照组，以及一组接受 TPETTBI 处理并在注射后 12 小时用 660 nm 激光照射的实验组。到 14 天治疗结束时，三个对照组的肿瘤体积迅速增大，而接受 TPETTBI 和激光照射的组中肿瘤体积显著减小。同时，治疗结束时 TPETTBI 和激光照射组的肿瘤重量也显著降低，表明在小鼠模型中光触发的抗肿瘤效果显著。此外，四组小鼠的体重均无显著差异，表明实验期间具有良好的生物安全性。
总结
我们提出了一种新颖的分子设计策略，将聚集诱导发射（AIE）、近红外（NIR）发射、线粒体靶向、优异的活性氧（ROS）生成以及高光热转换等特性整合到单个分子中，旨在通过大规模诱导免疫原性细胞死亡（ICD）来实现肿瘤根除。具体而言，通过合理的分子工程，我们赋予了 TPETTBI 扭曲的结构、两亲性和增强的供体 - 受体（D-A）强度，使其具有出色的线粒体靶向性、高效的 ROS 生成能力和高光热转换效率。体外成像结果证实了 TPETTBI 的线粒体靶向能力和荧光开启特性。体外和体内抗肿瘤研究均表明，TPETTBI 不仅可作为具有近红外二区（NIR-II）荧光监测能力的光疗剂，还能作为高效的 ICD 诱导剂。在生物组织透明窗口内，针对特定细胞器的光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）的协同效应，有助于有效且精准地根除肿瘤，并增强 ICD 的诱导。
参考文献
Strategically Designed Mitochondria-Targeting AIEgens for Effective Eradication of Primary and Metastatic Tumors via Synergistic Phototherapy and Induced Immunogenic Cell Death， Lin Yang, Jiachang Huang, Yanan Liao, Deping Hu, Yake He, Na Feng, Ryan T. K. Kwok, Jacky W. Y. Lam,* Jing Zhang,* Benzhao He,* and Ben Zhong Tang*， Adv. Healthcare Mater. 2025, 14, 2500513，https://doi.org/10.1002/adhm.202500513
