内容提要
将蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的蛋白质降解活性限制在癌症病变上，可以确保精确治疗。然而，在体内精确控制PROTAC在肿瘤区域的功能仍然是一个挑战。作者在此描述了一种近红外(NIR)光激活的纳米PROTAC (NAP)，用于肿瘤小鼠的远程可控蛋白水解。NAP是由PROTAC的两亲性共轭物通过单线态氧(1O2)可切割连接剂与近红外光敏剂连接而成的分子自组装形成的。PROTAC的活性最初是未被激活的，但可以在近红外光照射下远程启动，通过光敏剂产生1O2。作者证明了NAP能够以近红外光指示的方式使含溴结构域蛋白4 (BRD4)的肿瘤特异性降解。这与光动力疗法(PDT)相结合，引起肿瘤生长的有效抑制。因此，这项工作提出了一种新的方法来控制目标蛋白降解的PROTAC。
结果与讨论
作者设计了一种两亲性NAP前体(napp)，将亲水性BRD4 PROTAC ARV-771与疏水性NIR PS，亲磷化物a (PA)整合在一起。之所以选择ARV-771，是因为它在BRD4降解和癌症治疗方面的功能得到了充分的研究。选择PA的原因是其在近红外光照射下具有高的1O2生成能力，并且其刚性的平面结构还可以提供强的分子间疏水和π−π堆叠相互作用，从而促进两亲分子的自组装。ARV-771包括一个BRD4配体，通过烷基醚连接器与一个von Hippel - Lindau (VHL) E3连接酶配体连接。由于VHL配体中的羟基对于E3连接酶的募集是必不可少的，PA通过一个自焚的巯基连接体被引入到ARV-771的羟基部分。因此，ARV-771的功能一开始是惰性的，在近红外光照射下，在1O2介导的硫酮键的去除后才能被激活。阴性对照(NCP)前驱体(ncpp)同样被设计，而不是使用不可切割的烷基连接来取代napp中的硫酮连接。napp和ncpp的详细合成过程。简单地说，首先合成了可切割的2,2 ' -(丙烷- 2,2 -二基双(磺胺二基))-二乙醇和1,7-庚二醇，用碳酸4-硝基苯基对其进行修饰，然后与ARV-771中的羟基和衍生的PA中的氨基分别连接，得到napp和ncpp。主要中间体和最终产物通过核磁共振(NMR)和质谱(MS)确认。
NAP和NCP分别通过napp和ncpp在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中自组装制备。napp和ncpp的临界胶束浓度(CMC)分别为2.21±0.36 μM和2.74±0.41 μM，表明它们由于具有两亲性而易于在水溶液中自组装。
透射电子显微镜(TEM)成像显示NAP和NCP为球形形态，粒径相似。动态光散射(DLS)分析证实了它们相似的流体动力直径为~ 80 nm，表面电荷为~ +9 mV。NAP和NCP的多分散指数(PDI)分别为0.201和0.189。此外，NAP和NCP在生理条件下都具有良好的稳定性，在与生理相关的pH值(5.0 - 7.4)的PBS或37°C的血清中长期储存时，其大小变化可以忽略不计。
作者还研究了NAP和NCP的光学和光动力学性质。它们的紫外可见吸收光谱在距离PA 420和670 nm处有两个特征峰。NAP和NCP的荧光光谱相似，在680 nm处显示PA的特征发射。以单线态氧传感器绿色(SOSG)作为荧光指示剂，检测其生成1O2的能力。在670 nm近红外光照射下，NAP和NCP溶液在520 nm处的SOSG发射逐渐增加。NAP和NCP组的SOSG荧光增量在照射5 min后达到最大，分别为8.2倍和8.6倍。使用2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)作为陷阱的电子自旋共振(ESR)光谱分析也证实了NAP和NCP在近红外光照射下产生1O2。然后研究了NAP的光活化分解以释放PROTAC。TEM和DLS分析显示，NIR光照射5分钟后，NAP的纳米结构破裂，粒径增大，表明其已被分解。然而，即使在光照射后，NCP仍保持完整。此外，高效液相色谱(HPLC)分析显示，近红外光照射后，随着NAP中napp的消失(tR = 30 min)出现新的洗脱峰(保留时间tR = 11.3 min)，这归因于ARV-771的成功释放。NAP光疗后12 h, ARV-771的释放效率为85%。相比之下，NCP的ncpp (tR = 29.5 min)在相同的治疗后没有改变。这些结果证明了NAP对PROTAC的近红外光可控释放，这可以归因于1O2介导的硫代金属连接体的光导断裂。
接下来，作者评估了NAP和NCP对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞摄取和光动力学活性。流式细胞术监测PA荧光显示MCF-7细胞逐渐内化NAP，在12 h时达到平稳期。共聚焦荧光成像也显示NAP和NCP处理的细胞内PA有明显的红色荧光信号，平均荧光强度(mfi)分别为14.2和12.6。这些数据证明了NAP和NCP的有效和相似的细胞摄取。然后用2 '，7 ' -二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)研究它们的细胞内1O2的产生，H2DCFDA在被1O2氧化成2 '，7 ' -二氯荧光素(DCF)之前是不荧光的。近红外光照射5分钟后，NAP和NCP处理的细胞共聚焦荧光图像和流式细胞术表征显示出明显的DCF绿色荧光信号。NAP组和NCP组的DCF mfi分别比未照射的细胞高13.7倍和14.2倍，表明它们具有强大且相似的细胞内1O2生成能力。此外，在近红外光照射下，与NCP组相比，nap处理的细胞中PA荧光信号均匀分布在整个细胞质中，表明细胞内解体。
然后在MCF-7细胞中测试NAP对光调节蛋白的降解。Western blot分析显示，在黑暗条件下，浓度高达5 μM的NAP和NCP均不能调节BRD4蛋白水平。这与先前的报道一致，即占据VHL配体中的羟基可以取消其招募E3连接酶促进蛋白质水解的活性。相比之下，NIR光照射5min后，NAP而非NCP逐渐恢复蛋白质降解活性以去除BRD4。在光照射12 h后，随着NAP浓度从0.5 μM增加到5 μM，降解率从65%增加到97%。其他BET家族成员，如BRD2和BRD3，也在近红外光照射下被NAP降解。此外，这些数据表明，光本身和光动力效应不会改变BRD4水平。光照对ARV-771的蛋白水解活性也没有影响。此外，NAP的光启动蛋白水解过程依赖于泛素-蛋白酶体途径，因为它可以被蛋白酶体抑制剂MG132或nedd8激活酶抑制剂MLN4924阻断。
然而，在相同的处理之前，当VHL被敲除时，BRD4不能被降解，表明VHL依赖性蛋白降解。因此，这些结果证实NAP可以通过光诱导释放ARV-771在活细胞中实现近红外光驱动的蛋白水解。
作者使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)试验进一步测量了NAP在MCF-7细胞中的抗癌活性。与半最大抑制浓度(IC50)为0.32±0.05 μM的ARV-771相比，NAP (IC50 = 2.88±0.60 μM)和NCP (IC50 = 3.04±0.21 μM)在黑暗中由于阻断PROTAC功能而具有明显较低的细胞毒性。而NIR光照射5 min后，NAP和NCP的IC50值分别降至0.15±0.01 μM和0.64±0.13 μM。此外，光本身对细胞活力的影响可以忽略不计。此外，流式细胞术分析细胞凋亡也显示了类似的结果。与之前的报道一致，BRD4降解可以与PDT协同作用，这表明NAP可以实现协同治疗。总的来说，NCP的光疗作用可归因于PA的PDT效应，而NAP最明显的抗癌活性源于释放的ARV-771对BRD4的降解和PDT的联合作用。
受NAP在体外良好表现的鼓舞，作者继续探索其在体内的潜力。首先通过全身荧光成像研究NAP和NCP在小鼠皮下MCF-7肿瘤中的生物分布。静脉给药后，NAP和NCP处理小鼠肿瘤部位的PA荧光信号逐渐升高，在注射后8 h达到峰值。注射NAP和NCP的小鼠肿瘤的最大荧光强度(FIs)分别比背景高13.2倍和12.9倍。这些数据表明，NAP和NCP的有效和相似的肿瘤靶向积累可能是由于它们的小颗粒尺寸所支持的EPR效应。此外，离体荧光成像证实NAP与NCP的组织分布相似，在肿瘤和肝脏中积聚最多。因此，这些结果共同验证了PROTAC的肿瘤富集作用，这得益于其纳米配方。
最后作者进行了体内抗癌研究。每2天以等剂量的PROTAC (10 mg/kg)静脉注射NAP、NCP或ARV-771给MCF-7荷瘤小鼠。在每次注射后8 h，即肿瘤最大蓄积时间点，通过局部近红外光照射对NAP和NCP进行光激活。通过光疗前肿瘤内注射SOSG评估NAP和NCP在体内产生的1O2。与未照射组相比，注射NAP和NCP的小鼠肿瘤中SOSG荧光信号分别增加了33.4倍和36.9倍，证实了光动力作用。从初始肿瘤大小约120 mm3开始，在连续8次治疗期间监测肿瘤生长。第16天，NAP组和NCP组的肿瘤体积分别达到1462和1606 mm3，与PBS组(1635 mm3)相似。ARV-771 (810 mm3)和NCP光照射(+L) (895 mm3)减缓肿瘤生长，NAP +L引起最有效的肿瘤抑制(337 mm3)。在牺牲所有这些治疗小鼠并解剖肿瘤组织后，计算出基于肿瘤重量的ARV-771、NCP + L和NAP + L组相对于PBS组的肿瘤抑制率分别为52.4、55.1和83.4%。此外，单独光照对肿瘤生长无显著影响。这些数据表明，NIR光照射下的NAP在所有治疗方法中具有最高的治疗效果。
为了进一步证明NAP的作用，作者对解剖肿瘤组织进行了分析。Western blot和免疫组织化学分析均证实NAP + L和ARV-771组中BRD4蛋白显著降低，而NAP、NCP和NCP + L未改变BRD4水平。这些数据证实了NAP在体内对近红外光可控蛋白的降解作用。值得注意的是，NAP + L比ARV-771更有效地降解BRD4，这可能是由于PROTAC增强了肿瘤蓄积引起的。苏木精伊红(H&E)和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口端标记(TUNEL)染色显示NAP + L组的癌细胞死亡比其他组更明显，验证了治疗结果。相比之下，NAP具有良好的生物安全性，在治疗过程中未观察到明显的体重变化，也未观察到H&E染色对主要正常器官(心、肝、脾、肺、肾)的明显损害。综上所述，这些离体数据与体内治疗结果吻合良好，证明了NAP允许近红外光动力蛋白水解的安全有效的癌症抑制。
结论
综上所述，作者开发了一种近红外光激活的PROTAC，用于在活小鼠中进行时空可控的蛋白质降解。将PROTAC的两亲偶联物与NIR PS通过自牺牲的硫代链自组装，制备了纳米PROTAC (NAP)。NAP纳米制剂可促进PROTAC在肿瘤中的蓄积。体外和体内实验结果均表明，NAP只有在近红外光照射下才能产生1O2，从而破坏该连锁并释放活性PROTAC。精确控制BRD4降解，然后结合PDT安全有效地抑制肿瘤生长。此外，由于作者研究中用于PS并入的VHL配体被广泛用于PROTAC的开发，因此通过合理的设计，NAP应该是普遍适用的。这项工作为PROTAC在体内的光调控开辟了一条新的途径，也为可活化PROTAC平台的设计提供了重要的见解。
参考文献
Self-Assembled Nano-PROTAC Enables Near-Infrared Photodynamic Proteolysis for Cancer Therapy. Weishan Wang, Chenghong Zhu, Bin Zhang, Yi Feng, Yan Zhang, and Jinbo Li. J. Am. Chem. Soc., https://doi.org/10.1021/jacs.3c04109
