内容提要
外源分子的原位自组装是操纵细胞行为的一种强大策略。然而，在癌症细胞内将光化学惰性成分直接自组装成超分子纳米光敏剂（PS）用于精确的光动力治疗（PDT）仍然是一个挑战。在此，我们开发了一种糖基化的Aza-BODIPY化合物（LMBP），该化合物能够原位自组装成J聚集体纳米纤维，用于细胞膜破坏和I型PDT。LMBP选择性进入人肝癌HepG2细胞，并通过超分子相互作用依次自组装成细胞内J聚集的纳米囊泡和纳米纤维。详细的研究表明，这些J聚集的纳米结构仅通过光诱导的电子转移产生超氧化物自由基（O2-•），从而实现有效的PDT。此外，细胞内纳米纤维表现出聚集诱导的滞留效应，通过破坏HepG2细胞的细胞膜并与PDT协同作用，在体内产生强大的肿瘤抑制功效，从而对HepG2产生选择性毒性。
结果与讨论
从糖簇开发超分子组装体代表了一种很有前途的方法，用于设计可用于凝集素介导的各种治疗剂（如药物、基因、成像剂和药物蛋白）递送的装置。为了实现具有特定生物功能的稳定超分子组装体，使用乳糖构建了LMBP，这赋予了聚集体强大的生物受体结合能力和非凡的稳定性。此外，引入了Aza-BODIPY分子，因为对其结构的精细操作将允许构建J聚集体。制备缺乏乳糖的类似物MBP作为对照，以更好地了解靶向效率。所有化合物的合成路线在支持信息中提供，并在方案S1中说明。为了验证新化合物的结构，使用1H NMR、13C NMR和HRMS进行表征。此外，对从环己烷和四氢呋喃混合溶剂中生长的MBP单晶进行了X射线晶体学分析，证实了分子结构。
为了评估LMBP在水中的自组装行为，我们首先使用紫外-可见吸收和荧光光谱研究了其浓度依赖性光学性质。当浓度小于2 μM时，LMBP在570至740 nm之间显示出吸收带，最大吸收带在688 nm，这与其他Aza-BODIPY染料相当。随着浓度的增加，单体的吸收逐渐消失，在649 nm处出现蓝移吸收带。更有趣的是，当LMBP的浓度达到10 μM时，在740 nm处出现了额外的红移吸收带，表明LMBPJ的形成。我们推测，正如Würthner等人先前的研究所表明的那样，LMBPJ的这种独特的双频带吸收特征是由相邻LMBP的分子间电荷转移引起的。此外，与单体相比，LMBPJ的荧光量子产率显著降低，这意味着存在光诱导的分子间电子转移。使用圆二色性（CD）光谱研究了LMBP的自组装过程，该技术在深入了解染料聚集体的形成和堆积特性方面非常有效。LMBPJ的强Cotton效应表明，由于非共价相互作用引起的对称性破坏，Aza-BODIPY的分子间手性激子耦合。此外，通过电化学分析确定，LMBP单体和LMBPJ的电荷分离态的能级（ΔEcs）分别为1.5和1.1 eV[14d]。这些变化意味着LMBPJ应该能够实现激子耦合和近距离发色团之间的分子间电荷转移。此外，我们还比较了非糖基化分子MBP的自组装行为。向MBP的四氢呋喃溶液中逐渐加入H2O导致最大吸收波长蓝移到545nm， H-聚集体（MBPH）近红外（NIR）吸收峰的消失表明MBP的形成。如单晶结构所示，MBP分子通过π–π堆叠排列成H-二聚体模式。MBP和LMBP之间的这些显著差异充分证明了糖基化修饰对分子聚集状态的有效调节。为了研究LMBPJ的自组装过程，我们通过动态光散射（DLS）监测了组装体的尺寸。结果表明，在用水稀释LMBP的二甲基亚砜（DMSO）溶液1小时后，大多数组件具有约100nm的尺寸。值得注意的是，24小时后，组装体的尺寸增加到约420nm，表明发生了显著的形态转变。然后，利用透射电子显微镜（TEM）跟踪不同时间点的转变过程。在初始阶段，观察到外围和中心之间具有明显对比的球形结构，表明具有典型的囊泡形态，平均直径约为92 nm，与DLS结果一致。出乎意料的是，静置4小时后，溶液中出现了极少量约20 nm宽的短纳米纤维，随后，我们观察到纳米纤维的数量和体积增加，同时纳米囊泡的数量显著减少，这意味着从纳米囊泡向纳米纤维的蜕变。此外，融合的纳米囊泡间可以观察到，这表明囊泡之间存在显著的相互作用。更有趣的是，这些纳米囊泡倾向于粘附在预先存在的纳米纤维上，为这些纳米结构的融合提供了进一步的证据。先前的研究表明，碳水化合物之间的分子间氢键相互作用通常导致糖基化超分子纳米结构的形态转变。因此，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）被用来对两亲物之间的相互作用提供令人信服的见解。研究发现，初始纳米囊泡在3423 cm−1处的O−H拉伸峰在纳米纤维中向较低的波数（3404 cm−1）移动，这意味着在后者中形成更强的氢键。这一结果直接验证了LMBP在溶液中的高效串联自组装，为糖基化调节的微观分子间相互作用和宏观组装形态提供了证据。
然后，我们评估了使用LMBPJ作为高效O2-•发生器的潜力。最初使用了一种对任何类型的ROS有反应的商业指示剂，2，7-二氯二氢荧光素（DCFH），它会变为2′，7′-二氯荧光素（DCF），并在遇到ROS后发出绿色荧光。暴露于辐射后，含有LMBPJex的DCFH溶液的发射强度增加，在30秒内达到约3.4倍的增强。LMBPJ诱导的ROS量超过了亚甲基蓝（MB，一种典型的I/II型PS，2.7倍）作为阳性对照。有趣的是，与LMBPJ不同，MBPH未能产生ROS，这意味着激发态能级在聚集体中的分布可能是影响ROS产生的关键因素。为了更好地理解聚集态与ROS产生之间的关系，我们通过理论计算研究了LMBPJ和MBPH的激发态性质。利用B3LYP/6-31G（d）能级上的含时密度泛函理论（TD-DFT），计算了优化后的LMBPJ和MBPH的激发态能级。LMBPJ表现出比MBPH小得多的ΔES1-T1，促进了ISC，并使第一个激发三重态（T1）的产生能够产生ROS。DFT计算同时表明，LMBP J聚集体的自由能低于LMBP H聚集体的自由能，最终确定了自组装成LMBP J聚集体的明显倾向。随后在溶液测试中使用二氢罗丹明123（DHR123）作为O2-•荧光探针进行评估。当LMBP的浓度低于8.0 μM时，DHR123的荧光信号在照射后的变化可以忽略不计。随着LMBP和LMBPJ形成浓度的进一步增加，产生了O2-•，DHR123的荧光强度显著增加就是明证。这表明LMBP自组装对于光诱导O2-•的产生至关重要。
在相同条件下，LMBPJ产生O2-•的速率是MB的2.8倍。为了确定LMBPJ是否是一种特定的O2-•发生器，应用1O2特异性探针9，10-蒽二基-双（亚甲基）-二甲基丙烯酸（ABDA）来评估1O2的产生。LMBPJ在光照下不能降解ABDA，表明没有产生1O2。
考虑到•OH是通过与肿瘤细胞中的O2-•的级联反应产生的，是I型PDT期间细胞氧化损伤的主要原因，我们将超氧化物歧化酶（SOD）掺入溶液中，以验证H2O2和•OH的产生。SOD显著促进•OH的产生，具有强大的细胞毒性。此外，溶液中H2O2的存在也证实了这些•OH来源于O2-•的连续电子转移。这些结果证明了LMBPJ作为超分子I型PS的潜力。此外，电子自旋共振（ESR）光谱被用来证实O2-•的产生。在该方法中，5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）和2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮（TEMP）分别用作O2-•和1O2的自旋捕获剂或LMBPJunder光照射，观察到一种特征性的顺磁性加合物，表明产生了O2-•而不是1O2。通过考虑LMBPJunder进行I型电子转移以产生O2-•，使这种选择性合理化。整个过程可以简要描述如下。在光照射时，LMBPJ吸收光子以产生激发的单线态（1[LMBPJ*]）。在ISC和分子间电荷转移之后，形成了相应的阴离子自由基（[LMBPJ]-•）。然后将电子转移到分子氧中，产生O2-•。值得注意的是，大量研究表明，O2-•可以在细胞内引发一系列反应，从而诱导细胞的氧化损伤，同时抵消光化学反应中产生的氧气消耗。因此，人们普遍认为，与II型PDT相比，I型PDT具有更高的临床转化潜力。据我们所知，这是第一份使用J-聚集体作为特定O2-•发生器的报告。
考虑到LMBP的自组装是浓度依赖性的，LMBP单体可能会在细胞内积累并随后参与自组装。HepG2细胞显著过表达特异性识别半乳糖残基的ASGPR，这可能为探索LMBP原位串联自组装产生的生物功能提供了一个理想的平台。因此，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）最初用于在四种不同的细胞类型（HepG2、A549、HeLa和L02细胞）上用LMBP单体进行内化和选择性实验。这些结果清晰地表明在与LMBP孵育的早期阶段（5小时），只有HepG2细胞膜显示出明显的红色荧光，表明LMBP对HepG2电池具有显著的靶向作用。这与通过蛋白质印迹测定测定的这些细胞系中的ASGPR表达水平一致。
随后，通过荧光成像和流式细胞术仅在HepG2细胞中检测到强大的荧光信号。此外，竞争分析显示，用游离乳糖预处理HepG2细胞可以减缓LMBP进入这些细胞，这意味着游离乳糖和ASGPR之间的竞争性结合。此外，游离MBP对任何细胞类型都没有显示出亲和力。所有这些数据表明，构建的LMBP适合靶向HepG2细胞。重要的是，在用LMBP孵育25小时后，HepG2细胞内均匀分散的红色荧光发生了显著转变，转变为聚集的红色荧光点。此外，在40小时的时间点，在细胞中观察到具有更大体积的红色荧光纳米纤维，这表明LMBP的连续形态转化。TEM图像还显示HepG2细胞裂解物中直径为70–100 nm的纳米囊泡和直径约为25 nm的纳米纤维。因此，乳糖部分的结合成功地赋予了LMBP卓越的细胞选择性，这导致了LMBP在HepG2细胞中的浓度依赖性原位串联自组装。
然后，使用甲基噻唑基四氮唑（MTT）分析和活/死细胞成像在体外评估LMBP的生物相容性。令我们惊讶的是，用LMBP孵育50小时导致HepG2细胞活力显著下降。尽管一些研究表明细胞内纳米纤维引起细胞应激并导致细胞死亡，特异性细胞和生物学这一过程的机制尚不清楚。为了更深入地了解细胞活力下降的潜在机制，我们将HepG2细胞与LMBP孵育20小时，然后用不含LMBP的培养基代替原始培养基并继续培养。随后细胞活力的下降与用LMBP连续培养的细胞的下降一致。这些结果表明，细胞活力的降低是由于LMBP的自组装和随后的组装体形态转变，而不是过度摄取单体。我们进一步将与LMBP孵育的HepG2细胞的共聚焦图像的红色荧光通道转换为灰度图像。引人注目的是，我们的观察结果揭示了红色纳米纤维的存在，这些纤维延伸到细胞范围之外，并伴有细胞膜破坏的迹象。此外，垂死的细胞从细胞膜中排出大气泡，整个细胞通常肿胀，而细胞核保持完整。这些是由细胞膜穿孔引起的细胞膜肿胀和渗透溶解的显著特征，与具有完整和规则细胞膜的凋亡细胞截然不同。考虑到这些LMBPJ纳米纤维起源于细胞内，我们有理由相信，它们的巨大尺寸使它们难以从细胞中排出，导致它们在细胞膜附近积聚，最终导致细胞膜破裂并导致细胞死亡。乳酸脱氢酶（LDH）的释放是细胞膜损伤的常见标志物。我们的结果表明，纳米纤维在细胞内的积累导致LDH释放的急剧增加，表明LMBPJ纳米纤维对细胞膜的破坏。此外，TEM图像显示大量的纳米纤维在死亡的HepG2细胞中存在。相反，在活的HepG2细胞的裂解物中观察到更少的纳米纤维。这些发现表明，LMBP对HepG2细胞的毒性主要是由于LMBP纳米纤维对细胞膜造成的损伤。这突出了使用糖缀合物精确治疗肿瘤的潜力，尽管其潜在机制值得进一步研究。
接下来，考虑到LMBPJ强大的O2-•生成能力，我们使用DCFH研究了其在缺氧和常氧条件下的体外光活性。在光照射后，我们通过CLSM成像观察到显著的绿色荧光信号，表明无论氧气水平如何，LMBPJ都能有效地产生ROS。此外，还进行了二氢乙锭（DHE）染色测定，以检测细胞内O2-•生成。用LMBP和DHE处理的HepG2细胞在光照射后显示出特征性的红色荧光，表明DHE暴露于O2-•。值得注意的是，在用维生素C（Vc）预处理后，由于其O2-•清除作用，相对细胞内荧光信号被显著抑制。此外，使用探针单线态氧传感器绿色（SOSG）作为1O2指示剂，在HepG2细胞中未检测到1O2。值得注意的是，我们在HepG2细胞中发现了羟基苯基荧光素（HPF）在光照射下的绿色荧光，表明存在•OH。根据前面的描述，我们可以合理地推断，细胞内SOD促进了O2-•的歧化，随后通过Fenton反应或Haber-Weiss反应产生•OH。为了验证这一假设，我们使用了2-甲氧基雌二醇，一种有效的细胞内SOD抑制剂，来减弱SOD的活性，这反过来会阻碍O2-•向•OH的转化。当加入2-甲氧基雌二醇时，O2-•水平与未用SOD抑制剂预处理的细胞相比表现出显著的增加。此外，在相同的条件下，•OH的生成显著减少。我们通过检测不同条件下H2O2的水平，进一步阐明了细胞内级联反应的发生。细胞内H2O2水平受到光照和2-甲氧基雌二醇的调节，这提供了令人信服的证据，证明光诱导的H2O2是O2-•的下游产物。这些结果表明，LMBPJ诱导的O2-•参与细胞内的级联反应，这可能是在缺氧条件下维持良好水平的O2-•和•OH的原因。考虑到显著的细胞膜破坏和具有强大细胞毒性的•OH的产生，LMBPJ纳米纤维应该对HepG2细胞的生长具有协同抑制作用。因此，通过MTT法评估LMBPJ纳米纤维对HepG2细胞的暗毒性和光毒性。LMBP单体在20小时内对HepG2细胞没有暗毒性或光毒性，表明其具有良好的生物相容性。相反，LMBPJ由于其显著产生•OH而对HepG2细胞具有较强的光毒性。值得注意的是，LMBPJ纳米纤维+光处理对细胞活力的抑制作用最为显著，这是由•OH引发的氧化损伤和纳米纤维诱导的细胞膜损伤的组合作用引起的。令人兴奋的是，即使在缺氧条件下，LMBPJ也保持了其原始的光毒性，这与商业II型光敏剂二氢卟吩（Ce6）的光毒性显著降低形成了鲜明对比。这一观察结果表明，LMBPJ表现出较低的O2依赖性，在根除缺氧性肿瘤方面具有巨大潜力。为了更生动地观察PDT的效果，进行了钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶（钙黄绿素AM/PI）测定。钙蛋白AM染色活细胞以发出绿色荧光，而PI染色凋亡细胞以发出红色荧光。孵育50小时后，大部分HepG2细胞被清除，进一步证实了LMBPJ纳米纤维的优异治疗反应。细胞定量分析通过使用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒进行死亡。如流式细胞术所示，LMBPJ纳米纤维+光处理产生了74.4%的最高坏死率，这与MTT分析的细胞毒性结果非常一致。我们的结果表明，LMBPJ纳米纤维通过I型PDT和细胞膜破坏的协同作用诱导HepG2细胞死亡。
由于LMBPJ纳米纤维的显著保留，我们采用了一个小动物荧光成像系统来研究LMBP在携带HepG2肿瘤的BALB/c小鼠中的肿瘤特异性积累。静脉注射LMBP后，肿瘤部位可以清晰可见，并与周围组织区分开来，表明有显著的优先积聚。相反，在肿瘤中检测到可忽略不计的MBP信号，强调了LMBP的实质性肿瘤靶向能力。此外，LMBP在肿瘤部位的滞留时间延长至96小时，而肝、心、脾、肺和肾等主要器官的荧光信号在48小时后显著减弱，从而证实了LMBP的生物相容性。上述结果表明，LMBP表现出高积累和超长肿瘤滞留，特别是与没有乳糖单元的MBP相比。这种现象可归因于LMBPJ在肿瘤部位转化为纳米纤维所产生的积聚和滞留效应增强。
尾静脉注射LMBP（300 μL，15 μg mL−1）48小时后，对肿瘤进行730 nm的光照射，并记录随后14天的体重和肿瘤体积。所有组小鼠的体重都略有增加，表明LMBP对小鼠的副作用最小。LMBP给药显著抑制了肿瘤的发展，主要源于原位自组装LMBPJ纳米纤维对细胞膜的破坏。当肿瘤暴露于730nm光照射20分钟时，LMBPJ几乎完全抑制了肿瘤生长，这是由于与增强的PDT协同作用对细胞膜造成的损伤。在第14天处死小鼠，切除所有肿瘤组织并称重。治疗组肿瘤的大小和重量明显小于未治疗组。苏木精和伊红（H&E）染色结果显示，肿瘤样本中有大面积的细胞凋亡和坏死，表明给予LMBP和照射导致肿瘤组织损伤。此外，治疗组的主要器官中没有组织病理学异常，这表明LMBP在体内PDT应用是安全的。这些初步数据突出了LMBP作为一种PDT试剂的潜力，该试剂在体内具有增强的滞留性，可用于临床应用。
结论
总之，我们开发了一种用于肿瘤靶向PDT的原位自组装纳米系统。LMBP选择性进入HepG2细胞后，通过细胞内自组装和形态转化形成J聚集的纳米纤维。这种纳米结构不仅破坏了细胞膜，但也通过有效的光诱导电子转移产生O2-•，导致增强的I型PDT。体外和体内实验都证实了LMBPJ纳米纤维在HepG2细胞和荷瘤小鼠中的显著协同治疗作用。此外，LMBPJ纳米纤维在处理过程中具有理想的抗缺氧活性和长期滞留性，表明了使用糖基化发色团作为设计超分子治疗剂的新工具的潜力。我们的工作为生物材料和纳米药物的设计提供了一个新的视角。
参考文献
In Situ Self-Assembled J-Aggregate Nanofibers of GlycosylatedAza-BODIPY for Synergetic Cell Membrane Disruption and TypeI Photodynamic Therapy. Yi-chen Liu, Guang-jian Liu, Wei Zhou, Gai-li Feng, Qing-yuMa, Yuan Zhang, and Guo-wen Xing. Angew. Chem. Int. Ed.2023, e202309786. https://doi.org/10.1002/anie.202309786
