内容提要
羟基自由基(•OH)是一种非常有效的活性氧(ROS)，在缺氧肿瘤治疗领域的光氧化中起着至关重要的作用。然而，由于•OH/H2O对的高氧化电位，目前的•OH光生成方法通常依赖于需要紫外/可见光激发的无机材料。因此，基于有机分子的光发生器，特别是那些利用近红外(NIR)光激发的光发生器是罕见的。在这项研究中，我们引入了光诱导级联电荷转移(PICET)的概念，该概念利用近红外无重原子光敏剂(ANOR-Cy5)产生•OH。ANOR-Cy5光敏剂具有灵活的疏水结构，可以通过分子组装在水溶液中形成纳米颗粒。PICET涉及到一个对称破缺电荷分离诱导的局域电荷分离状态，过渡到一个非局域电荷分离状态，这决定了•OH生成的效率。由于•OH生成的氧不依赖性及其强大的氧化特性，基于ANOR - Cy5的光敏剂即使在严重缺氧条件下也能显示出高效的光诱导抗癌作用。这一发现强调了利用单个有机分子通过分子自组装工程实现•OH光生成的潜力，从而为光疗及其他领域开辟了新的可能性。
结果与讨论
分子设计与合成
五甲基菁(Cy5)是一种近红外(NIR)染料，具有很高的摩尔消光系数，使其成为一种优秀的光子捕获分子。近年来的研究表明，蒽衍生物修饰的Cy5化合物在近红外光照射下表现出高效的光活性，其效果优于重原子修饰的Cy5化合物。因此，我们选择了蒽基Cy5化合物(ANOMe-Cy5)作为光敏剂的主要分子支架。为了促进分子自组装的形成，将各种柔性疏水单元附着在ANOMe-Cy5上，形成一系列光敏剂(ANOR-Cy5)。
以ANOH-Cy5和不同的苄基溴衍生物为原料，采用方案S1的合成路线合成ANONO2-Cy5, ANOCF3-Cy5, ANOCOOCH3-Cy5和 ANOPh-Cy5。所有化合物的化学结构均通过1H NMR、13C NMR和ESI-MS分析数据确认。
水溶液中的分子自组装
我们首先测试了ANOR-Cy5化合物的稳态吸收光谱。新设计的化合物在水溶液中表现出明显的分子自组装，其吸收光谱的半峰全宽更宽，吸收光谱的吸光度更低，这与单体状态下在二氯甲烷中的吸收光谱不同。自组装程度最高的是ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5，其次是ANOCOOCH3-Cy5和ANOPh-Cy5。有趣的是，ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5在水溶液中形成纳米颗粒，透射电子显微镜(TEM)显示其粒径分别为20 nm和70 nm。然而，在ANOMe-Cy5组中很难观察到纳米颗粒的形成，动态光散射(DLS)测试也发现了类似的结果。这些发现表明，柔性疏水单元的加入导致了水环境中有效的分子自组装。
光诱导ROS生成
使用二氯二氢荧光素(DCFH)探针评估ROS生成的总效率，任何类型的ROS都可以产生525 nm的荧光。与ANOMe-Cy5相比，ANOR-Cy5光敏剂显示出显著提高的ROS生成效率，特别是在ANONO2-Cy5的情况下，其ROS生成效率与亚甲基蓝(MB)相当，后者是一种典型的近红外三态光敏剂，以其高效率而闻名。通常，光敏剂能够在水溶液中直接生成三种类型的ROS，即1O2、O2•−和•OH。为了确定特异性ROS的贡献，首先使用9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)探针和二氢乙二酸(DHE)探针分别评估了1O2和O2•−生成。与总ROS生成测试相比，与ANOMe-Cy5相比，ANOR-Cy5系统在1O2或O2•−生成方面没有任何显着改善。此外，所有Cy5基化合物的1O2生成都明显弱于MB，而MB是典型的具有高1O2生成量子产率的光敏剂。基于这些结果，我们假设ANOR-Cy5体系的•OH生成效率远高于MB和ANOMe-Cy5。作为这一猜想的证据，使用羟基苯基荧光素(HPF)在所有化合物中进行了•OH生成测试，这是一种稳定的针对•OH检测的开关荧光传感器。ANOR-Cy5体系在HPF中产生了显著的荧光，表明它能够高效地生成•OH，特别是ANONO2-Cy5，与MB和ANOMe-Cy5相比，它在•OH生成率方面具有压倒性的优势。为了进一步验证光诱导•OH生成的确定性，使用5,5-二甲基-1-吡咯啉n -氧化物(DMPO)对ANOR-Cy5体系进行了电子自旋共振(ESR)谱分析。在水溶液中光照射ANOR-Cy5体系时，观察到1:2:2:1的特征峰强度，这是由于•OH加合物与DMPO的共振。以上结果表明，基于ANOR-Cy5的化合物是高效的•OH光发生器。
•OH生成机理解释
为了研究•OH的产生机理，进行了瞬态吸收光谱(TAS)实验。有趣的是，我们发现分子自组装的光物理过程与单分子的光物理过程有很大不同。光子激发后，迅速形成局部激发态(S1)，然后发生SB-CS，将电荷转移到附近处于基态的分子上，产生局域电荷分离态(CSS1)。随后，CSS1状态进一步将电荷离域到整个分子组装中，从而形成离域电荷分离状态(CSS2)。值得注意的是，CSS2似乎是生成•OH的关键中间体。
图显示了水溶液中ANONO2-Cy5的TAS。在0.3 ps处的初始TA光谱表现出550-700 nm范围内的基态漂白(GSB)和400-550 nm范围内的光子诱导吸收(PIA)两个特征，在大约450和500 nm处有两个振动峰。值得注意的是，所有处于单分子状态的Cy5骨架衍生物染料都表现出这两个振动峰。因此，具有两个振动峰的PIA特征归因于S1- Sn的吸收，表明S1衰变过程中不存在中间物质。然而，对于分子自组装，在1.5 ps的时间尺度内，PIA光谱从典型的S1-Sn双峰特征转变为480 nm的单峰特征，表明中间物种的产生。根据光子敏化实验的结果，这种在480 nm处的单峰PIA特征是典型的Cy5•−吸收。因此，一个光子激发的S1分子可以通过分子组装中的SB-CS迅速将电荷转移到附近处于基态的另一个分子上，产生Cy5•−-Cy5•+ CSS1。然而，生成的Cy5•+物种在TAS中没有特征。光谱电化学和光敏化结果也表明，在350-1500nm范围内，Cy5•+没有明显的吸收特征，这可能是由于正电荷干扰了Cy5的共轭作用，导致没有吸收。为了进一步证明SB-CS电荷瞬态机制，我们还测量了Cy5固体膜的TAS。在固体膜中，Cy5分子彼此紧密堆叠，类似于ANOR-Cy5在水溶液中的情况。此外，固体膜中的堆叠程度应该比溶液中的分子自组装强烈得多，从而导致更快的SB-CS型电荷转移，可能在亚fs尺度内。因此，Cy5固体膜的TAS直接表现为典型的Cy5•−吸收光谱，没有明显的S1-Sn吸收特征。同样，在Cy5固体膜TAS中也没有Cy5•+的特征。除了在2ps范围内的快速SB-CS外，我们还观察到ANONO2-Cy5中Cy5•−特征衰减过程的两个步骤。Cy5•−特征的第一步快速衰减在1ns内。然后从1纳秒到7纳秒的第二步要慢得多。我们将Cy5•−特征衰变的第一步归结为一个分子填充粒子内从Cy5•−/Cy5•+向附近Cy5的电荷转移过程，将局域化的CSS1转变为离域化的电荷分离态(CSS2)。由于Cy5•−和Cy5•+在整个分子自组装粒子中离域，电荷重组速率相对较慢，导致CSS2寿命长。因此，CSS2有足够的时间窗口与H2O相互作用产生•OH。我们在Cy5薄膜中也观察到了这种电荷离域过程。在480 nm处，Cy5固体膜和水溶液中ANOCF3-Cy5的动力学曲线在20-500 ps范围内基本一致。
为了获得定量数据，提出了相应的序列模型进行全局拟合。成功对水溶液中三种分子自组装粒子的TAS数据进行全局分析，拟合的时间常数见表1。绘制了选定的动力学轨迹，以说明不同波长下的拟合质量。基于全局拟合结果，ANONO2-Cy5、ANOCF3-Cy5和ANOCOOCH3-Cy5的τSB-CS分别为1.13、0.98和1.78 ps。SB-CS在苝-3,4,9,10-双(二碳酰亚胺)(PDI)衍生物中得到了广泛的报道，根据分子距离和溶剂极性的不同，PDI衍生物的τSB-CS的范围从亚ps到数百ps。与具有特定分子距离的单分子PDI衍生物不同，Cy5衍生物的分子自组装系统可能具有一系列的分子距离分布。因此，一些较短的分子距离可能有利于高效的SB-CS。此外，在这种情况下，水的高极性是τSB-CS ~ 1ps的另一个关键因素。根据全局拟合结果，ANONO2-Cy5、ANOCF3-Cy5和ANOCOOCH3-Cy5的CSS2产率(ΦCSS2)分别为61.2%、45.0%和42.1%，这与HPF和DCFH测定的•OH代数和总ROS代数一致。这进一步证明了上述机制的合理性。
拟合TA Kinetics的参数
为了进一步研究•OH光发生器的分子自组装，进行了分子动力学模拟。化合物的组装形态和纳米颗粒密度表明，ANOR-Cy5的自组装程度强于ANOMe- Cy5。纳米粒子平均电荷最低的是ANONO2-Cy5，其次是ANOCF3-Cy5和ANOCOOCH3-Cy5，说明在ANOMe-Cy5中修饰疏水基可以降低静电斥力，促进纳米粒子的分子自组装。这一结果与TEM和DLS的实验结果一致。
研究了不同纳米颗粒在Cy5平面上法向量(φ)与半径向量(θ)夹角的分布。从图可以看出，ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5在图对角线上的分布概率要高于ANOMe-Cy5，说明ANOR-Cy5中柔性疏水基团修饰后，结构自由度受到很大限制。与ANOMe-Cy5相比，ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5中的小角度(<30°)分布概率增加，表明ANOR-Cy5体系中分子自组装模式倾向于Cy5框架的π-π堆叠，有利于电子的离域和CS态的稳定。
光诱导•OH生成和癌细胞铁死亡
鉴于ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5具有高效的•OH生成能力，我们利用小鼠乳腺癌4T1细胞进行了体外光活性实验。首先，我们通过MTT实验测试了两种化合物在常氧和缺氧条件下的光疗效果。
由于其良好的生物相容性和非重原子掺杂框架，ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5在黑暗中对4T1细胞的毒性可以忽略不计。在常压条件下(660 nm, 12 J/cm2, 10 min)近红外光照射后，两种化合物均以浓度依赖性的方式有效抑制4T1细胞的增殖。ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5分别在1 μM光处理后，约90%的4T1细胞被杀死。ANONO2-Cy5的PDT效率略好于ANOCF3-Cy5，因为前者具有更高的•OH生成效率。然而，在极低氧(2% O2)条件下，ANONO2-Cy5和ANOCF3-Cy5对4T1细胞表现出相似的光毒性，这可能是由于缺氧条件下4T1细胞中硝基还原酶导致ANONO2-Cy5中芳香硝基的减少。因此，产生不稳定的ANOH-Cy5和光毒性降低。在评估了具有高效•OH光生成和稳定化学结构的低氧条件下的可信光活性后，我们选择了ANOCF3-Cy5进行进一步评价。
通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步检测ANOCF3-Cy5对癌细胞的光活性。HPF和活死细胞成像的强烈细胞荧光表明，ANOCF3-Cy5在不依赖氧的情况下有效地产生•OH并导致癌细胞破坏。
为了进一步研究细胞死亡的机制，我们用不同的细胞死亡抑制剂ANOCF3-Cy5处理4T1细胞进行了MTT实验。自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤，3-MA)，坏死抑制剂(Necrostatin-1, Nec-1)和凋亡抑制剂(zVAD-fmk)与仅用ANOCF3-Cy5照射的对照组相比，没有明显的细胞活力恢复。相反，铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1, Fer-1)表现出明显的细胞活力增强，表明铁死亡可能是细胞死亡的主要途径。脂质过氧化(LPO)作为铁死亡的重要信号，首次在ANOCF3-Cy5处理的癌细胞中使用C11-BODIPY探针进行检测。氧化状态下，只有基于ANOCF3-Cy5的PDT组C11-BODIPY细胞内出现绿色荧光，且该荧光被Fer -1预处理后被淬灭，表明ANOCF3-Cy5介导的光处理确实引起了明显的LPO积累。另一方面，在近红外光照射(660 nm, 12 J/cm2, 10 min)下，ANOCF3-Cy5可抑制细胞内脂质过氧化物酶清除率GPX4的表达，Western Blot和CLSM免疫荧光均证实了这一点。此外，基于ANOCF3-Cy5的PDT组还观察到细胞GSH浓度降低和线粒体膜电位丧失。这些结果清楚地证实ANOCF3-Cy5可以通过产生细胞•OH有效地诱导细胞铁死亡。
体内研究
基于良好的体外实验结果，我们探索了ANOCF3-Cy5用于体内肿瘤治疗的可行性。在光动力治疗(PDT)前，通过皮下注射4T1细胞建立BALB/c小鼠实体瘤模型。当肿瘤达到约150mm3时，我们研究了体内荧光成像。由于其在水溶液中的自组装，ANOCF3-Cy5通过增强渗透性和滞留性(EPR)效应表现出显著的肿瘤靶向能力。ANOCF3-Cy5在肿瘤部位的荧光强度在注射后80分钟左右达到峰值，此时我们进行了PDT治疗。单次PDT治疗(660 nm, 100 mW/cm2, 10 min) 15天后，PBS组和ANOCF3-Cy5组的肿瘤增大了8倍以上，说明ANOCF3-Cy5和NIR光照射(660 nm, 100 mW/cm2)均未表现出抗肿瘤作用。然而，含有ANOCF3-Cy5和近红外光照射组表现出异常的肿瘤消退，几乎没有肿瘤生长，这可能是由于ANOCF3-Cy5在缺氧肿瘤中有效的•OH光生成。为了阐明其治疗机制，我们对肿瘤样本进行了评估。与体外实验结果一致，基于ANOCF3-Cy5的PDT组在肿瘤内显示了高效的LPO积累。此外，在ANOCF3-Cy5和光处理的肿瘤中，还观察到GPX4表达和GSH水平的明显抑制，进一步证明ANOCF3-Cy5的抗肿瘤机制是通过铁死亡途径介导的。因此，在ANOCF3-Cy5介导的PDT治疗的肿瘤中，观察到明显的细胞破坏和肿瘤增殖抑制，而在其他治疗组中未观察到广泛的细胞损伤。此外，我们密切监测小鼠是否有任何不良反应。值得注意的是，我们没有观察到所有组的任何主要器官出现明显的细胞坏死或炎症病变，并且在治疗期间没有小鼠出现任何体重异常变化。这些发现强调了ANOCF3-Cy5在体内系统中的生物相容性和适用性。
结论
总之，本研究介绍了一种利用PICET产生•OH光的新方法，重点是分子自组装。通过对蒽- Cy5骨架上的各种柔性疏水单元进行修饰，开发了一系列近红外光敏剂(ANOR-Cy5)，显著提高了•OH产率。在水溶液中，ANOR-Cy5可以自发形成纳米颗粒并经历PICET，从SB -CS诱导的局域CS状态过渡到非局域CS状态。产生离域CS态的概率与•OH的产率直接相关。基于ANOR - Cy5光敏剂的•OH生成不依赖氧的特性，即使在严重缺氧条件下也能显示出高效的光诱导抗癌作用，最终导致有效的体内肿瘤光消融。
虽然各种材料，如TiO2基纳米材料和有机多组分体系，可以实现高效的光诱导•OH生成，但它们对紫外-可见光激发、重原子掺杂和必要的牺牲电子供体/受体的依赖，为更广泛的应用提出了不可忽视的问题。相比之下，这项工作提供了有价值的参考，并提出了分子自组装诱导PICET的设计概念，特别是针对开发具有光诱导自由基生成的近红外重原子无光敏剂。这些创新为癌症治疗及其他领域的先进应用提供了令人鼓舞的前景。尽管如此，必须承认仍有未解决的问题，需要在未来进一步调查。具体来说，有必要进行更深入的探索，以确定以不同距离和角度为特征的特定分子堆积模式，从而诱发PICET。此外，还应重视分子修饰策略，增强分子填充，从而改善离域CS态的分布，提高自由基产率。同样重要的是，必须探索在替代发色团中实现基于PICET的激发态动力学，以取得该领域的潜在进展。
参考文献
Near-Infrared Self-Assembled Hydroxyl Radical Generator Based on Photoinduced Cascade Electron Transfer for Hypoxic Tumor Phototherapy. Xueze Zhao, Shan He, Junfeng Wang, Junying Ding, Shenglin Zong, Guohui Li, Wen Sun, Jianjun Du, Jiangli Fan,* and Xiaojun Peng，Adv. Mater. 2023, 2305163. https://doi.org/10.1002/adma.202305163
