行业文献

内容提要

   光动力疗法（PDT）的高度氧依赖性限制了其在临床上对低氧固体肿瘤的治疗效果，这是一个亟待解决的问题。在此，作者开发了一种不依赖氧的光动力学试剂，该试剂在无氧条件下，在细胞内存在大量丙酮酸的情况下，通过氧化水来产生羟基自由基（•OH）。设计了一种芴取代的BODIPY作为电供体，并与苝二亚胺作为电受体共同组装，形成四氢键的超分子动力学试剂。详细的机制研究表明，在光照射下，分子间的电子控制转移和电荷分离会有效地产生自由基离子对。在无氧条件下，阳离子自由基直接氧化水产生高细胞毒性的•OH，而阴离子自由基转移到丙酮酸上，实现催化循环。因此，即使在严重的低氧环境下，这种光动力剂也表现出超强的光细胞毒性。

结果与讨论

   在本工作中，作者设计了四重氢键单元2-脲基-4[1H]-嘧啶酮（UPy）修饰的电子供体（D）和受体（A）作为构建块来形成超分子PS。在四个协同氢键的自互补阵列中强烈二聚化的UPy单元被用作自组装超分子聚合物系统中的缔合基团。超分子PSDA是通过微乳液法从DandBy制备的。扫描电镜（SEM）成像和动态光散射（DLS）测试表明，纳米颗粒均匀分布在平均流体动力学直径为80.4±6.4 nm的球形中。DA的水分散体吸收波长为600 nm，发射波长为677 nm的微弱发射。它们在PBS和全介质中表现出优异的光稳定性和热稳定性。

   分别在常氧（21%O₂）、缺氧（2%O₂）和厌氧（0%O₂）条件下初步评估了DA的•OH生成。采用2,2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）作为检测•OH的指标，其可被•OH氧化并增强吸附。丙酮酸是细胞代谢中一种重要的基本成分，被作为电子受体添加到系统中以实现催化循环。在有氧和厌氧条件下，含有DA的ABTS溶液的吸收在光照下显著增加，表明DA在不依赖氧气的条件下有效地产生•OH。在没有丙酮酸的情况下，分子氧可以作为电子受体完成反应循环，但其效率远低于含有丙酮酸的系统，尤其是在低氧条件下（2%O₂）。在没有丙酮酸的厌氧条件下（0%O2），•OH的产生可以忽略不计，这表明丙酮酸在厌氧环境中是必不可少的。然后，使用一种常用的商业•OH荧光探针，羟基苯基荧光素（HPF），进一步检测•OH的生成，它可以被•OH氧化，并在520 nm处增强荧光。在高光照射下，存在DAI的HPF溶液的荧光在氩气氛下显著增加，表明在有氧环境下产生了•OH。为了进一步说明DADA共组装的必要性，作者测试了D或者A单独产生•OH的能力。在D或者A单独存在的情况下，检测不到•OH。此外，采用电子自旋共振（ESR）来证实通过DA的敏化产生•OH，其中选择5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉N-氧化物（BMPO）作为自旋抑制剂。在水溶液中照射DA时，观察到1:2:2:1的特征峰强度，这归因于•OH与BMPO加成物的共振。上述结果表明，无论有没有氧，DA都会产生•OH。

   然后，作者提出了在常氧和厌氧条件下光诱导生成•OH的机制。首先，光辐射激发物转变为激发态（D^+•），然后快速电子转移到附近，形成自由基离子D^+•和A^-•。一方面，阳离子自由基（D^+•）直接从分子水中获取电子，氧化水生成•OH；另一方面，阴离子（A^-•）将电子转移到合适的电子受体上，增强了上半胱氨酸的催化循环。在有氧条件下，分子氧作为合适的电子受体产生超氧化自由基（O₂^-•），而在极端缺氧环境（2%O₂）下，丙酮酸可以取代分子氧获得电子并被还原为乳酸，从而在无氧的情况下实现PS的催化循环。

   在强化上述机制的基础上，作者首次检测到特异性O₂^-•指示剂氢乙锭（DHE）产生超氧化自由基。DHE可被O₂^-•氧化形成乙锭，嵌入DNA并在580nm处发出明亮的荧光。在光照下，在存在DA的情况下观察到DHE的荧光增强，表明O₂^-•的产生。ESR光谱进一步用于以BMPO为自旋探针的O₂^-•检测。在含有5%DMSO的DA和BMPO的充气溶液作为•OH猝灭剂的光照下，观察到顺磁性加合物的特征信号，并将其与O₂^-•和BMPO加合物信号相匹配，从而指示O O₂^-•的产生。作为上述机制的另一个重要过程，丙酮酸的光还原通过1H NMR光谱和HRMS进行了评估。丙酮酸在2.54的质子信号降低，并且在¹H NMR谱中观察到乳酸的新形成的质子信号为1.94 ppm，表明在光照下丙酮酸还原为乳酸。HRMS证实在89.0231处达到峰值，被认为是乳酸的[M−H]⁻。

   光诱导电子转移和电荷分离在该系统中起着至关重要的作用。为了理解细胞间的电子转移，采用循环伏安法测定了D的氧化电位（E^ox）为+0.702 V（vs Fc/Fc⁺），A的还原电位（E^red）为-0.997 V（vs Fc/Fc+）。估算光诱导-电子转移自由能（ΔG）的方程式为

ΔG经计算为−26.05 kJmol−1，表明在光照下分子电传递的热力学可行性。

   根据经典的光物理理论，通过电子转移从单线态激发态比从三线态激发态更难实现电荷分离。这是因为三重态染料形成的自由基离子对由于自旋禁止进入而不太容易发生反向电子转移（BET）。因此，作者通过监测光敏剂三重态激发态的寿命变化来研究电子转移。此外，D、A和DA的电荷分离能力表现为对电流的响应和电荷转移电阻。DA表现出较强的光电流，而单独的A或者D在相同的条件下表现出可忽略的光电流。这些结果反映了D和A的共组装能够实现电荷分离。一致地，DA的电荷转移电阻远小于D或者A，这进一步表明了共组装后加速的电荷迁移率。

   可以用能带理论研究有机分子聚集物的氧化还原性质。水的氧化和氧或丙酮酸的还原取决于DA的价带（VB）电势和导电带（CB）电势。因此，从X射线光电子能谱（XPS）价带光谱中确定了DA的VB电势。DA的价带边缘最大能量为2.35 eV，计算出的DA的VB电位为2.11 V vs NHE。然后，用莫特-肖特基图分析DA的平带电位。测得的低频带电位为-0.45V vs NHE，与DA的CB电位近似相等。DA的VB电位比E_OH‑/OH•的电位更正，DA的CB电位比E_Lac/Pyr和E_O2-•/O2的电位更负。上述结果表明，DA能将水光氧化为•OH，并能光还原丙酮酸和O₂。

   受DA有效光敏生成•OH的激励，作者继续研究其PDT活性。首次通过共聚焦扫描显微镜（CLSM）在HeLa细胞中研究了DA的细胞摄取。在培养6小时的DA后，在细胞中观察到强烈的荧光信号，表明DA被HeLa细胞内化。细胞内化机制的研究表明，不同的内源性抑制剂和低温抑制了DAAs进入HeLa细胞，表明DA的摄取主要通过能量依赖性的内源性胞嘧啶途径。然后，作者通过各种商业指标评估了细胞内ROS的产生。

   •OH的荧光探针HPF用于评估在常氧（21%O₂）和低氧（2%O₂）环境下PDT过程中的细胞•OH。在光照后，在常氧和低氧环境下，通过共聚焦在DA处理的HeLa细胞中观察到HPF与•OH反应产生的强荧光信号，提示在上述条件下产生•OH。当添加DMSO作为•OH猝灭剂时，荧光信号被猝灭，进一步表明活细胞中产生了•OH。DCFH-DA和DHE还被用于证明HeLa细胞中ROS和O₂^-•的产生。然后，通过细胞计数试剂盒（CCK-8）测定来表征HeLa细胞的细胞存活率，以评估DA.DA的PDT效应，显示在正常和低氧条件下几乎没有暗毒性。用白光LED（40 mW/cm²）照射10分钟后，DA对HeLa细胞表现出明显的细胞毒性，其中半数最大抑制浓度（IC₅₀）为0.67 μg/mL，缺氧时为0.82 μg/mL。

   然后，使用钙黄绿素AM/PI测定法观察光照下DA对HeLa细胞的抑制作用，其中活细胞用钙黄绿素AM染色以在绿色通道中发出荧光，凋亡细胞用PI染色以在红色通道中发出萤光。光照（白色LED光，40 mW/cm²）5 min后，在DA处理的细胞的红色通道中观察到清晰的荧光信号，并且红色荧光信号随着DA浓度的增加而增加。当DA处理的HeLa细胞受到光照保护时，它们只发出绿色荧光，表明没有细胞死亡。

   作者用HeLa在BALB/c小鼠的皮下模型研究了免疫功能低下小鼠模型的PDT活性。首先，通过活体荧光成像实验测定了DA在肿瘤区域的富集时间。结果表明，DA在静脉注射后12 h在肿瘤区域富集。接下来，通过尾静脉注射给小鼠DA（500 μg/mL，50 μL），然后在注射后12小时在肿瘤部位照射处理（白光LED灯，140 mW/cm²）20分钟。

   在随后的14天里，小鼠的体重略有增加，与对照组相比，用DA和光照处理的组的肿瘤生长受到显著抑制。第14天处死小鼠，剥除所有肿瘤组织并称重。，治疗组的肿瘤大小和重量明显小于未治疗组。上述结果均表明，治疗组具有显著的抑瘤作用，系统细胞毒性可忽略不计。

结论

   作者首次报道了一种超分子光动力学试剂，它通过氧化水产生•OH，用于不依赖氧气的PDT。超分子光动力学试剂（DA）是由芴取代的BODIPY（D）和苝二酰亚胺（A）通过四氢-苯并二酰亚胺相互作用组装而成的。DA可以有效地产生•OH，并在无氧条件下将丙酮酸还原为乳酸。机理研究表明，导致电荷分离形成自由基离子对。一方面，D的阳离子自由基直接氧化水，通过不依赖于氧的方法生成•OH；另一方面，药物将DA转移到丙酮酸以实现催化循环。体外研究表明，DA对肿瘤细胞表现出性细胞光毒性，几乎不受细胞内氧分压的影响。进一步的活体实验表明，DA对肿瘤组织表现出不可逆的细胞毒性，导致明显的实体瘤消融。作者相信这项工作将激励探索用于癌症治疗的新型氧依赖性光敏剂。

参考文献

Supramolecular Photosensitizer Enables Oxygen-Independent Generation of Hydroxyl Radicals for Photodynamic Therapy. Kun-Xu Teng , Li-Ya Niu , Qing-Zheng Yang.J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 7, 4081–4087.https://doi.org/10.1021/jacs.2c11868