内容提要
金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染是一种对常规抗生素治疗和宿主免疫防御具有高度耐药性的主要感染性皮肤病，可导致细菌感染的复发和加重。在此，我们通过整合阴离子-π+ I型光敏剂(OMeTBP)和有机金属配合物(FeCO)，开发了一种光响应性一氧化碳(CO)释放纳米复合材料，用于治疗浮游金黄色葡萄球菌和生物膜相关感染。优化FeCO和OMeTBP的摩尔比后，制备的纳米颗粒OMeTBP@FeCONPs不仅保证了CO供体的充分负载和CO的高效生成，而且在光照射下，自由ROS的泄漏可以忽略不计，从而避免了过量ROS对组织的损伤。体外和体内实验结果均表明OMeTBP@FeCONPs能有效抑制金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和细菌生物膜。我们的设计有可能克服传统抗生素治疗的耐药性，为细菌感染提供更有效的选择。
结果与讨论
为了开发一种新型的CO光响应纳米系统，必须利用具有强大的I型ROS生成能力的ps。先前的研究表明，具有富电子阴离子-π+体系的ps可以促进强的分子内电荷转移(ICT)，从而导致激发态(3PS)的富电子环境。这反过来又促进了有效的系统间交叉(ISC)和有效的电子转移过程，导致I型ROS生成的优先增强。基于上述理论，我们合理地合成了两个阴离子-π+ ps, TBP和OMeTBP，它们由一个三苯胺部分和两个甲氧基(D)，一个苯并噻吩段(π桥)和一个吡啶基(a)组成。D−a的强度，以及扩展的π桥，可以帮助最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)分布的空间分离，从而促进了高效的ISC过程。随后，通过实验表征比较了两种ps的I型和II型ROS产率。首先，使用DHR123和HPF分别作为O2•−和•OH的特异性探针进行I型ROS检测。结果表明，两种ps在I型ROS的生成中表现出相似的趋势。此外，对1O2的检测结果表明，TBP可以在300s内产生大量的1O2, ABDA的吸收强度降低了60%。相比之下，外照射时OMeTBP产生的1O2最少。
为了了解它们之间的差异，首先利用ORCA程序和时间相关密度泛函理论(TD-DFT)研究了它们的系统间交叉(ISC)过程。使用ORCA进行自旋-轨道耦合(SOC)矩阵元素(ξ)，其中，OMeTBP的ξ值在S4至T3 (4.72 cm−1)和S4至T4 (4.03 cm−1)之间较大，TBP的ξ值在S5至T3 (2.39 cm−1)和S4至T3 (7.07 cm−1)之间较大。这些结果表明在两个PSs中存在有效的ISC通道。
在O2•−的生成过程中，PS (3PS)的三重态可以首先从环境中获得电子，生成的自由基阴离子(PS•−)会进一步将电子转移给氧。因此，O2•−生成的可行性高度依赖于周围的电子给体和ps的还原电位。我们计算了两种ps的HOMO和LUMO能级，根据公式S1可以得到TBP和OMeTBP对应的还原电位值，分别为0.0378 V和- 0.0827 V。这表明两种ps都可以通过I型途径产生O2•−，这有利于电子的接受。
对于•OH的生成，一种途径是将电子从环境羟基阴离子(OH−)直接转移到3PS，导致自由基阴离子(PS•−)和•OH的形成，其中中间PS•−还可以通过分子间电荷转移进一步提供O2•−。随后，在wB97XD/ def2SVP水平下，3TBP和3OMeTBP生成•OH和中间PS•−所需的能量(ΔG)分别为- 42.64和- 35.60 kcal/mol。显著负ΔG值表明通过该途径生成I型ROS在热力学上是有利的。另一种途径是通过一系列反应，如歧化反应、Haber-Weiss反应和Fenton反应，将生物微环境中先前生成的O2•−转化为•OH。这些结果证实了两种PSs产生I型ROS的显著潜力。
在能量传递途径上，计算了两种ps的T1-S0垂直发射能，并与3O2 ~ 1O2的激发能进行了比较。OMeTBP的T1−S0发射能(1.36 eV)明显低于3O2到1O2的激发能(1.68 eV)，而TBP (1.67 eV)的激发能与1O2相当。这表明与OMeTBP相比，TBP更容易促进3O2到1O2的激发。考虑到TBP产生的过多的1O2可能导致氧化组织损伤，不能被CO供体有效消耗，因此选择OMeTBP作为更合适的诱导CO产气的PS。CO给体FeCO配合物的合成路线见辅助信息。值得注意的是，为了验证I型ROS触发CO生成的可行性，我们使用了CO探针来检测OMeTBP和FeCO化合物混合物中的CO释放。在照射20 min后，CO探针的荧光强度明显增强，说明OMeTBP可以作为光刺激触发CO生成。
为了制备纳米颗粒，将OMeTBP和FeCO溶解在四氢呋喃(THF)中，然后在超声波下注入F127水溶液中。值得注意的是，当OMeTBP和FeCO的摩尔比为1:10时，形貌达到最佳。纳米颗粒的平均尺寸约为56 nm, zeta电位为−17.4±0.83 mV。此外，EDS元素图谱显示，铁、硫和氧元素都被包裹在纳米颗粒中，源自FeCO。
纳米颗粒制备成功后，进行CO和I型ROS生成的检测。在光照下，我们检测了一系列在OMeTBP和CO供体之间具有不同摩尔比的纳米颗粒。结果表明，OMeTBP@FeCONPs (OMeTBP:FeCO = 1:10)的CO产率最高，而OMeTBP@FeCONPs (OMeTBP:FeCO = 1:1)的CO产率最低。重要的是，为了确保FeCO在这种功率照射下的光稳定性，我们在不添加PS的情况下测量了CO探针和FeCONPs混合物在连续照射下产生的CO。对照组的CO产量很低，CO探针的荧光强度增加不到2倍。此外，还评估了I型活性氧的消耗。与纯PS相比，OMeTBP@FeCONPs (OMeTBP:FeCO = 1:10)在20min光照下仅产生可忽略不计的游离•OH，其HPF荧光强度仅提高了1.98倍。同时，含有10倍和20倍CO供体的NPs产生的CO气体和•OH的趋势非常相似。这些结果表明，用于制备纳米颗粒的10倍CO供体足以消耗大部分游离•OH并将其转化为CO分子。因此，后续研究采用OMeTBP@ FeCONPs (OMeTBP:FeCO = 1:10)。为了评估OMeTBP@FeCONPs对正常组织的潜在生物毒性，同样采用相同的方法制备TBP@FeCONPs，并与正常3T3细胞孵育，比较其与OMeTBP@FeCONPs的细胞活力。在黑暗和光照条件下，OMeTBP@FeCONPs孵育的3T3细胞表现出最小的细胞毒性，而TBP@FeCONPs在光照下显著降低细胞活力至65%左右。这些发现表明，OMeTBP是一种更合适的触发CO治疗的PS，同时最大限度地减少对正常组织的氧化损伤。此外，OMeTBP@FeCONPs在缺氧条件下表现出与正常氧条件下相似的高CO释放效率趋势，表明I型ROS生成的低氧依赖性能。值得注意的是，制备的纳米颗粒在不辐照一定时间的情况下对CO探针和PdCl2的稳定性进行了测量。结果显示没有荧光变化，进一步证明CO的生成是由外部光可控触发的。
CO给体OMeTBP和相关的OMeTBP@FeCONPs的紫外可见光谱如图。ICP-OES测量使我们能够确定这些纳米颗粒中的FeCO浓度，发现其为11.85 mg/L。随后，利用血红蛋白(HB)方法61监测CO随时间的释放过程。20min时，释放的CO浓度达到6 μmol/L，由式S2可知。此外，对照组在没有外部照射的情况下几乎保持不变。这些结果表明，在光照射下，OMeTBP@ FeCONPs具有很高的CO释放效率，使其成为光触发CO治疗细菌感染的有希望的候选材料。
鉴于OMeTBP@FeCONPs具有良好的产CO效率，对金黄色葡萄球菌和生物膜的抑菌活性进行了评价。通过铺板法测定金黄色葡萄球菌在光照下暴露于不同浓度的OMeTBP@ FeCONPs后的存活率。在光照条件下，当OMeTBP@ FeCONPs浓度达到20 μM时，细菌几乎全部被杀死，说明光刺激下纳米颗粒具有有效的抗菌活性。相比之下，在黑暗条件下，不同浓度的纳米颗粒孵育后，金黄色葡萄球菌略有失活，可能是因为CO分子在没有光照的情况下很少释放。活/死荧光细菌染色进一步揭示了在光照下OMeTBP@FeCONPs处理金黄色葡萄球菌的有效抗菌活性，碘化丙啶染色的死细胞荧光证明了这一点。生物膜的特点是其三维细胞外基质结构，这是抗菌治疗的重大障碍。这是因为这种基质可以保护封闭的微生物免受抗菌药物和宿主免疫细胞的攻击，使它们对常规治疗具有很高的抵抗力。随着浮游细菌的成功根除，我们进一步评估了该策略在消除生物膜方面的功效。
为此，我们建立了金黄色葡萄球菌生物膜，实时研究纳米颗粒的渗透和积累。纳米粒子孵育后，在共聚焦显微镜下观察生物膜。共聚焦图像显示，在10分钟内，纳米颗粒几乎被生物膜完全填充，可见强烈的红色荧光信号，表明OMeTBP@FeCONPs在生物膜中快速积累。此外，采用各种方法评估纳米颗粒的抗生物膜活性。在光照下用20 μM OMeTBP@ FeCONPs处理金黄色葡萄球菌生物膜，细菌数量显著减少，存活率约为10%，与浮游细菌的观察结果一致。金黄色葡萄球菌WHGFP生物膜PI染色显示，与对照组相比，OMeTBP@FeCONPs加光照培养的生物膜中PI阳性的金黄色葡萄球菌较多，说明CO对生物膜进行了有效的处理。此外，结晶紫染色后，OMeTBP@FeCONPs或光单独处理的生物膜呈深紫色，而OMeTBP@FeCONPs加光处理的生物膜颜色变浅。这些体外实验突出了OMeTBP@FeCONPs在光照下治疗浮游细菌和生物膜相关感染的潜力。
鉴于OMeTBP@ FeCONPs在体外抗菌实验中的良好表现，我们随后评估了其在抗菌感染中的潜力。通过皮下注射金黄色葡萄球菌(S. aureus)、金黄色葡萄球菌-绿色荧光蛋白(S. aureus- gfp)和MRSA分别进入BALB/c小鼠皮肤组织，建立一系列皮肤细菌感染模型。12 h后，将感染基因座sc注射OMeTBP@ FeCONPs，在给药0.5 h后进一步进行白光照射。金黄色葡萄球菌在光照射下被显著消灭，存活的金黄色葡萄球菌数量下降到19%左右。然而，在黑暗条件下，金黄色葡萄球菌的存活率在所有组中保持不变。
此外，我们对金黄色葡萄球菌- GFP在光照下用OMeTBP@FeCONPs孵育后进行共聚焦成像。光照组感染皮肤中细菌的绿色荧光远弱于对照组和暗照射组，且光照组的绿蓝荧光比较其他两个对照组急剧下降。这些结果表明，OMeTBP@FeCONPs在光照射下具有最高的胞内CO生成效率。接下来，我们测试了OMeTBP@FeCONPs对MRSA感染模型(一种难以治疗的细菌菌株)的疗效，以验证其在光反应性CO治疗中的优越抗菌效果。
结果显示，与OMeTBP@FeCONPs在光照下孵育后，MRSA被显著根除约80%，其杀菌活性远高于临床抗生素氨苄西林。第7天，取创面皮肤切片，进行组织化学分析。组织学分析显示，与其他对照组相比，受OMeTBP@FeCONPs +光照感染的皮肤炎症细胞浸润水平降低，皮肤组织结构正常，表明其对炎症抑制和组织再生有有益作用。从图可以看出，金黄色葡萄球菌感染的组织与正常组织相比确实具有明显的缺氧环境，其中缺氧探针表现出更强的绿色荧光。同时，OMeTBP@FeCONPs也表现出较强的抗大肠杆菌效果，进一步验证了纳米颗粒的抗菌普遍性。我们进一步进行了体内生物安全性评估。结果显示，与健康小鼠相比，血液生化参数和收获的组织没有明显异常，表明OMeTBP@FeCONPs的肝毒性和肾毒性可以忽略不计。这些发现证明了我们的方法具有理想的生物安全性，这对其潜在的临床抗菌应用至关重要。
结论
综上所述，我们已经开发出一种光响应纳米复合材料，用于高效的CO气体生成，以消除S.金黄色菌和生物膜感染。我们的方法利用阴离子π+ I型PS产生ROS自由基，有效地触发负载CO供体释放CO，解决光触发CO治疗中CO释放效率有限的问题。为了克服细菌感染组织缺氧环境导致CO释放受限的问题，根据计算和实验结果，选择OMeTBP作为合适的I型PS。体外和体内实验结果表明，我们的杂交纳米球对浮游金黄色葡萄球菌、MRSA和细菌生物膜具有良好的抗菌活性。总的来说，我们构建的光疗OMeTBP@FeCONPs由于其出色的抗菌能力和生物相容性，在未来的临床应用中具有很大的潜力。
参考文献
Type-I Photosensitizer-Triggered Controllable Carbon Monoxide Release for Effective Treatment of Staph Skin Infection.Lei Cao, Xuan Lin, Xingang Liu, Min Wu, Shitai Liu, Tongtong Wang, Duo Mao, and Bin Liu.Nano Lett. ,https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.3c02434
