内容提要
本文开发了一种小分子指示剂可用于生物样品中 NAD（P）H 的比色和荧光检测。该设计基于花菁染料支架，并利用一种新型的双受体 “开启” 机制。因此，在生理条件下，该指示剂对低微摩尔水平的 NAD（P）H 具有前所未有的灵敏度和快速响应。通过 NAD（P）⁺依赖的葡萄糖脱氢酶（GDH）的酶偶联反应，在葡萄糖诊断分析中证明了该试剂的价值。我们展示了该指示剂在活细胞中对 NAD（P）H 成像的实用性。我们使用线粒体呼吸缺陷的人结肠癌细胞系证实了其反映不同 NAD（P）H 水平的能力。将该指示剂的应用扩展到高级组织模型中，我们证明了其能够可视化肿瘤球体缺氧核心的不同代谢状态。
结果与讨论
NAD（P）H 氧化还原指示剂的设计与合成
花菁染料由于其优异的光物理特性，是设计荧光探针的有吸引力的平台。由于缺乏共轭官能团，通常难以在花菁分子的 π- 电子系统中实现可逆变化。通过利用 NAD（P）⁺/NAD（P）H 对的独特光谱特性，在这些染料中引入 “开启” 机制是可能的。当 NAD（P）⁺被还原为 NAD（P）H 时，烟酰胺部分转化为二氢烟酰胺。结果，260nm 处的吸收带降低，并且由于二氢烟酰胺部分在 360nm 处出现新的最大值。这种红移是由于形成了 π- 共轭供体 - 受体系统，其中二氢吡啶部分的氮原子提供电子密度，酰胺基团作为受体。因此，这种颜色变化的化学基础可以转移到用于生物应用的花菁类氧化还原指示剂的设计中。
我们设计并合成了一系列六种二季铵盐。作为阴性对照，我们还设计了化合物 2，其中氮相对于共轭吲哚鎓基团位于间位。在这种情况下，由于不存在 π- 共轭供体 - 受体系统，预计不会发生红移。带正电荷的二季铵盐 1-6 是水溶性的（>5mM），并在约 360-380nm 处显示特征吸收带。这种跃迁的高能量是由于存在两个电子受体部分。在 NADH 存在下记录的光谱支持我们通过 2A 设计激活比色响应的假设。化合物 1 和 3-5 在可见光谱的绿色区域显示出显著的红移。此外，化合物 6 在近红外区域显示出新的吸收带。只有 “对照” 化合物 2 没有光谱响应。这种模块化设计允许独立改变每个组件，并便于为特定应用定制指示剂。我们选择分子 1 作为进一步功能评估的先导结构，因为它对 NAD（P）H 显示出非常快速和高度灵敏的响应，这在生物分析应用中是有价值的。
指示剂 1 的传感特性
在 25°C 的 PIPES 缓冲液的生理条件下，对指示剂 1 及其对 NAD（P）H 的响应进行了光谱评估。游离指示剂 1（5μM）呈浅黄色，在 312 和 384nm 处有宽吸收峰。向 1 的溶液中加入过量的 NAD（P）H 后，在 537nm 处迅速出现新的吸收带，并在数小时内保持稳定。吸光度的增加非常强烈，肉眼很容易分辨出红移。我们检查了 1 的荧光发射光谱的变化：NAD（P）H 的结合导致在 561nm 处的荧光强度增强了近 30 倍（量子产率 QY = 0.4%）。有趣的是，所得荧光团的光物理性质与三甲川花菁非常相似。为了理解这一点，我们确定了所得染料的结构。我们预期喹啉鎓部分会转化为二氢衍生物。根据关于 3 - 取代喹啉鎓盐与 NAD（P）H 类似物反应的文献，预测了这种行为。结果似乎对于在 3 位具有吸电子取代基的化合物是普遍的。它们更容易在喹啉鎓部分的 4 位而不是 2 位受到攻击。
我们研究了在低 NADH 浓度下 1（50-250μM）的动力学响应，如图所示。1 的对照溶液（100μM）在 537nm 处没有明显变化。同时，引入 NADH（5μM）后，吸光度在 5 分钟内达到平台期。对动力学数据的进一步分析给出了 190.5 ± 9.3M⁻¹s⁻¹ 的二级速率常数（k₂），这表明对 NADH 的响应快速。重要的是，所测试的溶液在室温下稳定数小时，因为在吸收光谱中未检测到明显变化。快速的动力学曲线、稳定性和低背景信号促使我们进一步研究指示剂 1 对 NADH 的传感。用不同浓度的 NADH（0.3-20μM）处理指示剂 1（100μM）。如图所示，随着 NADH 量的增加，观察到吸光度逐渐增强。在这些条件下，获得了高度线性的响应（n = 29；R² = 0.996），相应的检测限为 0.1μM NADH（3σ/m）。斜率（m = 76.1 ± 0.9 OD₅₃₇/mM）证明化合物 1 是 NADH 最灵敏的比色指示剂之一。
指示剂 1 通过 NAD⁺/GDH 偶联反应对葡萄糖的传感
指示剂 1 检测 NAD（P）H 辅因子的能力允许监测 NAD（P）⁺依赖的酶及其底物的活性。为了证明这一点，我们应用指示剂 1 在 NAD（P）⁺依赖的葡萄糖脱氢酶（GDH）存在下分析葡萄糖。1 能够直接接受来自 NAD（P）H 的氢化物的能力使得传感方案更简单。GDH 催化葡萄糖氧化为葡糖酸内酯，同时将 NAD⁺还原为 NADH。所得的还原辅因子与 1 反应，导致 1Cy 的形成和吸光度的增加。在 NAD⁺/GDH 存在下用葡萄糖处理 1 时的时间依赖性光谱变化如图所示。指示剂 1 显示出强烈的响应，并且在 10 分钟内可以很好地检测到葡萄糖。对照实验表明，在反应混合物中排除 NAD 或 GDH 时，1 的吸光度保持不变。因此，酶促反应对于激活 1Cy 的形成是必不可少的。这个实验还表明，指示剂 1 在分析的所有组分存在下相当稳定。我们研究了其在葡萄糖定量检测中的应用，葡萄糖定量检测是临床诊断中的常规测量。检测限确定为 0.1μM（n = 24），突出了 1 在酶促反应中的优异性能。此外，1 对葡萄糖的光谱 “开启” 响应比最近报道的黄递酶 - 试卤灵平台更快、更灵敏（45 分钟，0.2μM）。总之，这些结果表明，由于其独特的设计结构，指示剂 1 是生物系统中 NAD（P）H 的有效探针。
化合物 1 对培养细胞的染色及在细胞内 NAD（P）H 传感中的应用
为了评估 1 在分析细胞内 NAD（P）H 水平方面的适用性，我们首先分析了它对细胞中存在的各种化合物的交叉反应性。这个实验证实，化合物 1 对 NAD（P）H 的反应性明显高于其他氧化还原活性分析物，如抗坏血酸、半胱氨酸和 FADH₂，因此使其成为基于细胞实验的 “NAD（P）H” 探针。因此，我们检查了它对培养的哺乳动物细胞染色的能力。使用 HEK-293 细胞系，我们观察到在短短 30 分钟内有效的细胞内积累，没有急性毒性作用。在染料浓度为 20μM 时，细胞在染色 0.5-24 小时后仍保持活力。后来通过用膜完整性 CellTox Green 染料染色证实了最小或没有细胞毒性，该染料可染色死细胞。我们还发现内化过程在很大程度上取决于细胞活力，对于死细胞可以忽略不计。对于人结肠癌细胞 HCT116，我们观察到主要在细胞质内分布，部分与线粒体重叠。由于转化为 1Cy 形式及其高摩尔消光系数，细胞内的指示剂 1 显示出明亮的可见荧光。然而，荧光显微镜的另一个重要参数是光稳定性。为了评估这一点，我们将 1Cy 在细胞中的光稳定性与广泛用于线粒体功能分析的 TMRM 染料进行了比较。在相同的采集设置下，两种染料显示出相似的光稳定性。为了进一步分析，我们选择了 HCT116 野生型和 SCO2⁻/⁻敲除细胞系，它们在能量产生途径的使用和氧化还原水平上有很大差异。野生型细胞依赖于氧化磷酸化和糖酵解，而 SCO2⁻/⁻细胞的氧化磷酸化失活，导致更高的 NAD（P）H 水平。用指示剂 1 染色的比较表明，SCO2⁻/⁻细胞显示出大约 50% 更高的 NAD（P）H 量，证实了其在活细胞中对这些分析物的反应性。由于指示剂 1 不可逆地转化为荧光形式，它不能用于时间推移测量（未显示）；然而，它非常适合于快速终点评估 NAD（P）H 水平。
肿瘤球体模型中 NAD（P）H 的成像
我们还研究了 1 在分析高级组织模型（如肿瘤球体）中的适用性。多细胞球体能够更好地模拟体内条件、细胞间相互作用和对药物治疗的反应。我们从野生型和 SCO2⁻/⁻细胞系中制备了球体，用 1 染色并分析了 NAD（P）H 水平。首先，我们发现 1 能够在短短 3-6 小时内对形成的 100-300μm 球体聚集体进行染色。然而，长期孵育（3 天，“预染色” 样品）导致指示剂染料降解。我们解释这是由于其转化为荧光形式并进一步从细胞中清除。使用从野生型和 SCO2⁻/⁻细胞产生的球体染色，我们观察到 SCO2⁻/⁻样品中通常有更高水平的 NAD（P）H。值得注意的是，对周边和核心的比较显示，野生型细胞球体中 NAD（P）H 有明显的梯度，而敲除细胞系中几乎最小。野生型球体核心中 NAD（P）H 的急剧减少与之前揭示的 HCT116 球体中存在缺氧核心密切相关。这可以解释为球体缺氧核心中的细胞代谢活性较低和 NADH 产生减少，并证明了指示剂 1 如何可用于分析 3D 细胞模型或肿瘤外植体中的 NAD（P）H 梯度。
总结
我们通过在可调谐花菁染料的骨架上引入一个 NAD (P) H 反应位点（双受体设计），设计出了一种新型小分子 NAD (P) H 指示剂（1）。化合物 1 已被证明是一种高灵敏度、快速响应的 NAD (P) H 指示剂，在可见光谱的绿色区域有强烈的 “开启” 吸收，并且荧光发射增强（开 / 关比高达 30 倍）。这样的光谱特性使其能够与其他荧光染料（例如 EGFP 或磷光 O₂（生物）传感器）兼容。我们证明了它能够检测水溶液中微摩尔水平的 NADH，或追踪 NAD⁺依赖的生物催化转化。我们的研究表明，指示剂 1 能够在极短的染色时间（0.5 - 3 小时，取决于细胞模型类型）内对哺乳动物细胞中的 NAD (P) H 进行活细胞成像，这对广泛的基于活细胞和组织的实验模型是有益的。特别是，在二维和三维环境下的肿瘤细胞模型（HCT116 SCO2⁻/⁻相较于野生型）中，指示剂 1 对细胞内增加的 NAD (P) H 量表现出良好的响应。该化合物对 NADH 和 NADPH 具有同等的反应性，但可以通过更复杂的方法对这些化合物进行区分。对三维球体相对容易的染色表明它与复杂组织模型中 NAD (P) H 梯度的简便分析具有良好的兼容性。
参考文献
Two-Acceptor Cyanine-Based Fluorescent Indicator for NAD(P)H in Tumor Cell Models, Maksim A. Fomin, Ruslan I. Dmitriev, James Jenkins, Dmitri B. Papkovsky, Dieter Heindl, and Burkhard Konig*, ACS Sens. 2016, 1, 702−709, DOI: 10.1021/acssensors.5b00315
