内容提要
程序性癌细胞死亡(PCD)的实时成像是监测癌症治疗效果和制定治疗方案的必要条件;然而，肿瘤内焦亡的特异性体内检测仍然具有挑战性。本文报道了一种双锁定串联激活探针(DTAP)，用于近红外荧光(NIRF)成像活小鼠肿瘤化学免疫治疗期间的瘤内焦亡。该探针包括一种双锁的半花青碱染料，该染料具有酶反应性片段，可以被与热作用相关的生物标志物(Caspase-1)和癌症生物标志物(GGT)同时切割，从而打开其NIRF信号。由于焦亡在触发抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用，DTAP的激活信号与肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞的数量和肿瘤生长抑制有很好的相关性，从而可以预测癌症的治疗效果。本研究也为研究焦亡在癌症治疗中的调控机制和优化精准医学的癌症化学免疫治疗提供了一种无创技术。
结果与讨论
合成与表征
DTAP的合成路线见方案S1(辅助资料)。首先，合成了一种半花青碱染料(CyOH)。然后将受保护的GGT底物(Fmoc-Glu-OtBu)与自毁性连接剂对氨基苯醇(PABA)偶联，随后将羟基溴化，使其亲核取代到CyOH上，通过降低CyOH上氧原子的供电子能力来阻断NIRF信号。然后去除Fmoc基团以提供CyOH-γ-Glu-OtBu。之后，通过固相肽合成法制备保护形式的Casp1肽底物N-acetylTyr(tBu)-Val-Ala-Asp(OtBu)-OH，并与CyOHγ-Glu-OtBu的游离胺基连接。然后去保护OtBu得到化合物CyGC。最后，通过铜(I)催化叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)将PEG -炔催化为CyGC，得到DTAP。
控制探针SAP的合成路线。同时，以不含PEG链的DTAP化合物CyGC和Casp1切割CyGC后的产物CyG作为对照进行体外鉴定。所有新化合物均通过1H NMR、13C NMR和LC-MS谱进行了表征。
体外表征测试
DTAP被设计为仅在与Casp1和GGT反应时激活，以打开其NIRF信号。为了研究DTAP对Casp1和GGT的响应，作者通过评价DTAP在4种不同生理条件下的紫外-可见吸收和NIRF发射来表征DTAP的光学性质。DTAP最初在610和660 nm处有两个吸收峰，NIRF可以忽略不计。在GGT和Casp1同时存在的情况下，在660 nm处的吸收急剧增加;与不加酶相比，DTAP在710 nm处的NIRF强度提高了37倍。当DTAP与Casp1或GGT孵育时，观察到微弱的荧光增强。双锁定CyGC的吸收和发射变化与DTAP相似。相比之下，单锁SAP仅与Casp1孵育后，其吸收和发射发生了显著变化。有趣的是，CyGC的荧光增强(7.8倍)远低于DTAP(37倍)和SAP(48倍)，这可能是由于没有PEG的CyGC溶解度较差。
高效液相色谱(HPLC)分析验证了CyG和SAP在每个靶酶作用下的结构变化以及Casp1和GGT对CyGC的串联裂解。DTAP在去离子水中的DLS谱图表明，没有形成纳米颗粒。计算得出Casp1在DTAP上裂解的Michaelis常数(KM)和催化速率常数(kcat)分别为11.52 × 10−6 m和0.013 s−1，催化效率(kcat/KM)为1.14 × 103 m−1s−1。有趣的是，计算出SAP上Casp1切割的kcat/KM为2.20 × 103 m−1s−1，比DTAP高1.9倍，这表明γ-谷氨酸对Casp1切割有抑制作用。为了进一步研究GGT与Casp1反应后在DTAP上的裂解反应动力学，作者计算出GGT在CyGP (Casp1裂解DTAP的产物)上的裂解KM、kcat和kcat/KM分别为9.34 × 10−7 m、0.062 s−1和6.66 × 104 m−1s−1。更重要的是，在与凋亡相关的生物标志物(Caspase-3/Casp3)、癌细胞过表达的溶酶体蛋白酶(Cathepsin B/CatB)、促进癌细胞转移的溶酶体蛋白酶(Cathepsin C/CatC)或癌症免疫反应相关的丝氨酸蛋白酶(Granzyme B/ GranB)一起培养后，DTAP的NIRF信号可以忽略，证实了它的高酶选择性。
相比之下，由于Casp1和Casp3共享相似的序列，单锁SAP被Casp3部分切割，并具有7.3倍的NIRF增强。这些数据清楚地证明了DTAP的高特异性及其被Casp1和GGT串联激活。Casp1本身只裂解 n-乙酰基- Tyrl - Val - Ala - Asp，形成没有NIRF开启的CyGP，可被GGT进一步裂解以提供荧光CyOHP。GGT不能直接切割DTAP，因为GGT特异性识别γ-谷氨酸的α-氨基，而γ-谷氨酸被DTAP中的n -乙酰基- Tyr - Val - Ala-Asp阻断。
细胞热亡的体外成像
DTAP对GGT阳性小鼠乳腺癌细胞(4T1)和ggt阴性小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)的焦亡成像能力进行了研究。用顺铂(Cisp)激活Casp1诱导细胞焦亡，然后用DTAP孵育。与未处理的4T1细胞相比，cisp处理的4T1细胞的NIRF信号增强了4.5倍。相比之下，当Casp1或GGT失活时，在4T1细胞以及GGT阴性的NIH3T3细胞中观察到最小的NIRF信号。在这种处理条件下，细胞形态保持完整。在Cisp处理较长时间的4T1细胞中，观察到类似的NIRF信号增强。此外，当4T1细胞用SAP孵养后，经热分解特异性刺激物(脂多糖和尼日利亚菌素)和Cisp处理，也检测到NIRF信号分别增强2.6倍和3.5倍。然而，在Cisp处理的NIH-3T3细胞中，SAP的荧光开启表明其在非癌细胞中的非特异性激活，这很容易导致正常组织发生焦亡的假阳性信号。结果表明，串联活化的DTAP在检测肿瘤焦亡方面比单锁的SAP具有更好的选择性。
为了研究探针信号与体外焦亡水平的相关性，作者研究了Cisp处理的4T1细胞焦亡的下游信号通路。免疫印迹和免疫细胞化学分析显示，Cisp处理的4T1细胞中Casp1的表达高于未处理的细胞。免疫细胞化学分析还显示，Cisp处理的4T1细胞中n端GSDMD 的表达明显高于未处理的细胞。由于N-GSDMD可以在质膜上寡聚形成GSDMD孔，诱导离子内流引起细胞肿胀，在Cisp处理的4T1细胞中，在细胞膜破裂前发现了明显的大热沉泡，最终导致细胞裂解，释放细胞内内容物。细胞培养上清的ELISA分析证实了Cisp处理后4T1细胞中炎症因子(IL-18和IL-1β)的形成和释放。其他细胞内内容物，如乳酸脱氢酶(LDH)，也因热噬细胞裂解而释放。5-(3-羧基-甲氧基苯基)-2-(4,5-二甲基噻唑基)-3-(4磺苯基)-四氮唑(MTS)实验结果证实了Cisp诱导的细胞凋亡导致的细胞活力降低。这些结果表明，Cisp诱导4T1细胞强烈的焦亡，这与DTAP的高离体NIRF信号相吻合，验证了DTAP在癌细胞中出色的焦亡检测能力。
焦亡的体内实时成像
在4种不同的腹腔治疗方案下，研究了DTAP对肿瘤治疗引起的瘤内焦亡的体内实时成像能力:i)生理盐水，ii)单免疫治疗(抗PD-L1，α-PD-L1)， iii)单化疗(Cisp)， iv)联合化疗免疫治疗(α-PD-L1/ Cisp)，其中Cisp是一种典型的体内诱导焦亡的化疗药物，α-PD-L1是一种免疫检查点阻断抑制剂，与癌细胞膜表面的PD-L1受体结合，使癌细胞对免疫细胞杀伤敏感。治疗后，将DTAP静脉注射到纵向获取NIRF图像的活小鼠体内。α-PD-L1/Cisp联合治疗小鼠的肿瘤中出现了明显的高信号，且信号强度在注射DTAP后4 h达到最大，分别比Cisp-、α-PD-L1-和盐水处理小鼠高2.2倍、3.8倍和3.3倍。除肿瘤外，在注射DTAP后1小时内，α-PD-L1/Cisp联合处理的活小鼠肾脏中也观察到NIRF信号，表明DTAP在肿瘤中激活后，肾脏会迅速清除。DTAP的药代动力学如图所示。注射后4小时器官匀浆的HPLC分析显示，DTAP在肾脏和肿瘤的重要器官中大量积累。主要器官的离体成像进一步证实了活化DTAP在肾脏和肿瘤中的大量积累。测定DTAP的血清半衰期为1.6 min。注射DTAP 24 h内，肾脏清除率达到61%的平台值。然而，即使在注射后48小时，活化的DTAP也没有完全代谢。最重要的是，与单锁SAP相比，DTAP在Cisp处理的无肿瘤小鼠和LPS处理的小鼠中未被激活，这表明DTAP在肿瘤内焦亡而不是在正常组织中发生的焦亡和腹膜炎中特异性激活。
为了研究DTAP是否可以作为预测癌症治疗效果的预后工具，活体小鼠中DTAP的瘤内NIRF成像信号与治疗导致的肿瘤生长抑制(TGI)相关。α-PD-L1/Cisp联合化疗对肿瘤体积增大的抑制作用最大，其次为Cisp单药。这是因为α-PD-L1/Cisp联合协同发挥强大的全身和肿瘤内免疫应答，与单独Cisp相比，显著减弱肿瘤生长。由于4T1免疫原性较差，α-PD-L1本身未能抑制肿瘤生长。此外，TGI与实时肿瘤内NIRF信号相关性良好，Pearson相关系数(P)为0.93，表明DTAP对癌症治疗疗效具有预测能力。虽然由于Cisp的肾毒性，α-PD-L1/Cisp联合或单独使用Cisp治疗的小鼠体重在第3天后急剧下降，但在第11天后体重终于恢复正常，表明α-PD-L1/Cisp联合治疗的毒性是可以接受的。生化分析和组织学染色也显示DTAP在小鼠体内具有较高的生物安全性。
肿瘤免疫微环境(TIM)中焦亡的离体成像
为了了解热亡在TIM中的作用，作者测量了肿瘤中反映瘤内热亡水平的DTAP的离体NIRF信号，并将其与化疗免疫治疗期间肿瘤引流淋巴结(TDLNs)和肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞的树突状细胞(dc)数量相关。肿瘤切片的免疫组织化学分析显示，与盐水处理的对照组相比，α-PD-L1/Cisp联合治疗小鼠的DTAP信号显著增强(10.3倍)，随后进行Cisp单次化疗(7.5倍)，而α-PD-L1单次免疫治疗小鼠的DTAP信号仅增强4.1倍。免疫组织化学和免疫印迹分析显示，这一信号趋势与Casp1的表达水平吻合良好。通过ELISA检测，α-PD-L1/Cisp联合治疗小鼠血清中IL-18和IL-1β的含量明显高于其他治疗方案。
最有趣的是，流式细胞术分析显示，α-PD-L1/Cisp联合治疗的肿瘤中成熟DCs和细胞毒性CD8+ T细胞数量增加。Casp1表达的增强倍数、IL-18、IL-1β的数量、成熟DCs的数量以及细胞毒性CD8+ T细胞的数量与肿瘤切片中DTAP的离体NIRF信号密切相关。这些结果与先前的研究结果一致，证实了焦亡可以通过释放大量的炎性细胞因子(IL-18和IL-1β)，将细胞毒性CD8+ T细胞募集到肿瘤微环境中，从而协同抗肿瘤免疫应答。在α-PD-L1对免疫检查点的抑制下，CD8+ T细胞可以通过MHC I分子与肿瘤细胞表面呈现的肿瘤抗原结合，释放GranB进一步促进肿瘤凋亡，最终建立一个正反馈回路，实现肿瘤的破坏。DTAP的信号在与抗肿瘤免疫应答协同作用时，很好地显示了焦亡的这种抑瘤作用，显示了DTAP能够无创地研究焦亡在肿瘤消退中的作用。
结论
作者开发了一种NIRF探针(DTAP)，该探针可以灵敏地激活其荧光信号来指示肿瘤内焦亡水平，用于实时和无创地评估癌症化学免疫治疗。DTAP是双重激发的，它可以被Casp1和GGT联合激活，以确保其对肿瘤内焦亡的特异性。这在细胞中得到了证实，在发生焦亡的4T1癌细胞中，DTAP的特异性荧光开启，而在发生焦亡的非癌性NIH-3T3细胞中，DTAP的特异性荧光开启。由于其被动的肿瘤积累，DTAP还可以在癌症治疗期间实时成像活体小鼠的瘤内焦亡。它能特异性地区分肿瘤内焦亡与正常组织或腹膜炎中发生的焦亡。DTAP中与焦亡相关的NIRF信号与肿瘤浸润细胞毒性CD8+ T细胞的数量密切相关，这归因于焦亡和抗肿瘤反应的协同作用触发ICD。这也解释了为什么化疗-免疫联合治疗比单一治疗更能抑制肿瘤生长。TGI和DTAP的NIRF信号之间强烈的正相关关系允许其用于预测癌症治疗效果。据作者所知，DTAP是第一个双锁和串联激活的分子光学探针，能够通过活体小鼠肿瘤内焦亡的实时成像来预测癌症治疗效果。因此，本研究推动了分子光学成像在筛选癌症治疗药物以触发焦亡以有效治疗癌症方面的应用。
参考文献
A Dual-Locked Tandem Fluorescent Probe for Imaging of Pyroptosis in Cancer Chemo-Immunotherapy. Xinzhu Wang, Shasha He, Penghui Cheng, and Kanyi Pu*. Adv. Mater. 2023, 35, 2206510. https://doi.org/10.1002/adma.202206510.
