内容提要
高质量的二次近红外(NIR-II)纳米探针对实时生物成像和医学诊断具有重要意义。菁氨酸是构建可激活探针的一类重要荧光团;然而，它们在生物学上的应用仍然面临着重大挑战，包括水溶液中荧光弱、不稳定性和特异性不足。本文采用综合设计策略，开发了明亮、发射稳定、特异度高的基于花青素的可活化NIR-II纳米平台。具体来说，采用聚苯乙烯-共马来酸酐(PSMA)包封NIR-II荧光分子(IR1048)，使NIR-II纳米颗粒(PSMA@IR1048 NPs)稳定明亮。通过电荷调节策略，一系列菁荧光团被加载到PSMA@IR1048 NPs表面，并对活性物质表现出可调的响应。结合这两种策略，构建了NIR-II比例荧光纳米探针(RNPs，包括RNP1、RNP2和RNP3);其中，RNP2表现出次氯酸(HClO)响应性能，产生更高的NIR-II荧光比(FL2/FL1)信号。这种纳米探针可以可靠地报告糖尿病肝损伤模型和下肢缺血再灌注(I/R)损伤小鼠的病理HClO水平。作者的研究为构建基于花青素的稳定、明亮、特异的NIR-II生物成像探针奠定了设计策略。
结果与讨论
NIR-II荧光纳米颗粒的构建和表征
寻找合适的光学荧光团是开发新型和有前途的NIR-II纳米材料的关键起点。在这些荧光团中，IR780是典型的基于花青素的荧光团，具有较强的荧光发射。但其稳定性差，在水溶液中的溶解度不足，极大地限制了其在生理环境中的应用。为了提高IR780在水溶液中的光学性能和化学稳定性，作者选择了一系列聚合物(如DSPE-PEG、F127、PS-PEG、PSMA@PEG-NH2和PSMA)通过一步纳米沉淀法封装IR780。首先，作者研究了游离IR780染料的化学稳定性以及包被IR780纳米粒子的两亲性聚合物对HClO的化学稳定性。加入HClO后，游离IR780染料、DSPE-PEG@IR780 NPs、F127@IR780 NPs和PS-PEG@IR780 NPs的吸光度峰(780 nm)急剧下降，而PSMA@IR780 NPs在780 nm处的吸光度没有明显变化。同时，作者通过羧基和氨基的交联反应对PSMA@IR780 NPs表面的聚乙二醇-氨基(PEG-NH2)进行修饰，得到PSMA@PEG-NH2@IR780 NPs。在HClO存在下，PSMA@PEG-NH2@IR780 NPs在780 nm处的吸光度迅速下降。PSMA@IR780 NPs优异的稳定性可能归因于其极低的zeta电位，从而导致PSMA@IR780 NPs与HClO之间存在强烈的静电斥力。
接下来，将IR1048与各种两亲性聚合物结合，构建NIR-II纳米颗粒(两亲性polymer@IR1048 NPs)。DSPE-PEG@IR1048 NPs和PSMA@IR1048 NPs的吸收光谱显示出IR1048 (~1048 nm)的特征峰，证实IR1048可以成功地融入到DSPE-PEG和PSMA中，而F127@IR1048 NPs和PS-PEG@IR1048 NPs在1048 nm处的吸光度可以忽略，因此后续的实验使用了DSPE-PEG和PSMA。接下来，作者优化了两亲性polymer@IR1048 NPs的配方(不同百分比的PSMA和DSPE-PEG)。随着PSMA含量从0到100%的增加，作者发现两亲性polymer@IR1048 NPs在水溶液中的NIR-II荧光强度逐渐增加。然后，作者研究了两亲性物质polymer@IR1048对HClO的化学稳定性。值得注意的是，DSPE-PEG@IR1048 NPs (100% DSPE-PEG, 0% PSMA)的吸光度在HClO孵育后明显下降。然而，随着PSMA百分比的增加，两亲性polymer@IR1048 NPs逐渐稳定，并且在HClO存在下，PSMA@IR1048 NPs (100% PSMA)在1048 nm处的吸收没有明显变化。同时，两亲性polymer@IR1048 NPs的zeta电位随PSMA含量从0% (- 19.93 mV)逐渐降低到100% (- 53.37 mV)。这些结果表明，与DSPE-PEG相比，PSMA可以提高IR1048在水溶液中的荧光强度和化学稳定性。因此，作者选择PSMA作为表面活性剂，并为后续实验选择了最佳质量比(PSMA:IR1048 = 60:1)。
接下来，作者对PSMA@IR1048 np进行了表征。PSMA@IR1048 NPs可以很好地分散在水中，并从透射电子显微镜(TEM)图像(约30 nm)中呈现球形形态。PSMA@IR1048 NPs在H2O中的NIR-II荧光强度高于游离IR1048染料在H2O/MeOH中的NIR-II荧光强度。同时，PSMA@IR1048 NPs与不同反应物质孵育后，吸光度和荧光无明显变化。结果表明，在不受活性物质干扰的情况下，NIR-II在水溶液中呈现出明亮、稳定的荧光，表明加入PSMA后，IR1048的光学性质和化学性质都得到了显著改善。
NIR-II RNPs的构建与性质
迫切需要开发活化的NIR-II荧光探针，使其在与靶标反应后改变其荧光信号。值得注意的是，比例成像可以提供可靠的生物标志物在体内的可视化;因此，比率NIR-II探针的发展是有希望的。由于PSMA@IR1048 NPs具有优异的光学性能，通过羧基(-COO−，带负电荷)和季铵盐(N+，带正电荷)的静电相互作用，将一系列菁荧光团(IR780、IR775S和IR796)加载到PSMA@IR1048 NPs表面构建RNPs， IR780/IR775S/IR796和IR1048的比例为3:1至6:1 (780 nm至1048 nm的吸光度比)。为了验证在PSMA@IR1048 NPs上成功装载了基于花青素的荧光团，作者进一步研究了RNPs的光学性质(吸收光谱和荧光光谱)以及化学性质(化学稳定性和光稳定性)。值得注意的是，RNPs表现出菁荧光团的特征吸收峰(780 nm)和强荧光发射(820 nm)。相比之下，由于这些荧光团在水溶液中的溶解度较差，这些菁荧光团在MeOH/H2O(1/99)中表现出广泛的吸收和弱荧光发射。这些结果表明，在PSMA@IR1048 NPs表面加载后，菁荧光团的荧光性能得到了提高。此外，RNPs在NIR-II窗口有明显的荧光(激发波长为808 nm)。同时，RNPs核心(PSMA@IR1048 NPs)的荧光可以忽略不计(激发波长为808 nm)。因此，当激发波长为808 nm时，NIR-II荧光来源于负载在表面的花青素荧光团。
其次，研究了菁荧光团和RNPs对过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2)、半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、超氧阴离子自由基(O2•−)、羟基自由基(·OH)、ONOO−、HClO等各种活性物质的化学稳定性。正如预期的那样，在加入活性物质后，游离菁荧光团(IR780、IR775S和IR796)的吸收光谱明显下降，这表明在活性物质存在的情况下，这些分子被破坏，尤其是ONOO−和HClO。然后，作者通过吸收光谱和荧光光谱测试了RNPs对活性物质的化学稳定性。值得注意的是，在存在活性物质的情况下，RNP1的吸光度和荧光几乎是恒定的，这表明RNP1具有很高的稳定性。
有趣的是，除了HClO外，RNP2在780 nm处的吸光度和820 nm处的荧光在各种干扰物质孵育后都没有明显变化，这表明RNP2具有特异性的HClO响应特性。此外，在HClO或ONOO−孵育后，RNP3的吸光度和荧光明显下降。因此，这些分子在表面加载后的化学稳定性与IR780(+1)、IR775S(0)和IR796(−1)的电荷有关。IR780分子的净电荷为+1，静电吸附能力增强，化学稳定性显著提高。当分子(IR775S和IR796)含有0和- 1的净电荷时，它们的静电吸附减弱，使它们更容易被HClO或HClO/ONOO−破坏。
此外，作者还测试了RNPs在激光照射下的光稳定性。在高功率密度激光(808 nm， ~200 mW/cm2)照射180 s后，游离菁荧光团和ICG的吸光度急剧下降。与此形成鲜明对比的是，RNPs的最大吸光度在照射180 s后没有明显衰减，这表明RNPs的光稳定性得到了改善。此外，在PBS中孵育30天后，RNP2的吸光度没有明显变化，并且在孵育48 h期间，RNPs表现出恒定的zeta电位和优越的胶体稳定性。因此，这些结果表明RNPs具有出色的光稳定性。
RNP2对溶液中HClO的响应。
RNP2表面的IR775S被认为是HClO的响应分子，在HClO存在下，IR775S表现出“关闭”NIR-II荧光(FL1，激发:808 nm)。同时，RNP2核心的IR1048对HClO足够稳定，从而提供了鲁棒的NIR-II输出信号(FL2，激励:980 nm)。从TEM图像来看，RNP2呈球形(~30 nm)，在水溶液中分散良好。然后，作者测试了RNP2在pH 7.4的PBS缓冲液中的HClO响应性能。随着HClO浓度从0 μmol/L增加到20 μmol/L, RNP2在780 nm处的吸光度逐渐降低，而在1048 nm处的特征吸收峰变化可以忽略。值得注意的是，作者观察到780 nm处的吸光度与HClO浓度之间存在良好的关系(R2 = 0.994)。反应动力学显示，RNP2在780 nm处的吸光度逐渐下降，在HClO孵育5分钟后接近平台。作者进一步用InGaAs NIRvana CCD相机采集了无HClO和有HClO时RNPs的荧光图像。RNP2在与HClO孵育前在808 nm (FL1)和980 nm (FL2)激发时均表现出明亮的NIR-II荧光(1100-1700 nm)，而与HClO孵育后FL1荧光明显减弱。作者通过将FL2图像除以FL1图像进一步构建比率图像(FL2/FL1)。正如预期的那样，RNP2的FL2/FL1比值随着HClO浓度的升高而逐渐增加。同时，作者测量了加入HClO后RNP2的荧光光谱，发现RNP2中IR775S的特征峰明显降低，而IR1048的特征峰没有明显变化。在820 nm处，荧光强度与HClO浓度(0 ~ 20 μmol/L)呈良好的线性关系(R2 = 0.997)， RNP2的检出限为0.6 μmol/L。最后，作者测试了RNP2对各种活性物质的选择性，在HClO存在下，FL2/FL1比值提高了约30倍，表明RNP2对HClO具有良好的特异性。
糖尿病小鼠的比例荧光成像
糖尿病是一种以血糖水平升高为特征的代谢紊乱。在高血糖状态下，肝脏(调节葡萄糖代谢的主要器官)异常升高的葡萄糖发生氧化磷酸化，可导致ROS过量产生。此外，有大量证据表明，ROS在糖尿病的进展和发展中起着不可或缺的作用。因此，实时检测HClO水平对于糖尿病的辅助诊断具有重要意义。受RNP2对溶液中HClO良好选择性的启发，作者进一步利用RNP2进行糖尿病小鼠HClO水平的实时成像。
糖尿病小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ, 75 mg/(kg d)，共注射4次)，该药物对胰腺β细胞具有特异性毒性，导致高血糖。作为对照，选择生理盐水注射小鼠作为健康小鼠(1组)。为了对不同进展阶段的糖尿病小鼠进行成像，分别在STZ给药的第2天(2组)、第5天(3组)和第8天(4组)注射RNP2。同时在指定时间点记录糖尿病的基本指标(体重、血糖水平)。接下来，从第5天开始给糖尿病小鼠注射二甲双胍(200 mg/(kg d)，共7次)，以减轻糖尿病期间的氧化应激(第5组)。
各组小鼠的体重，1组和2组无显著差异，2 - 4组小鼠的体重逐渐下降。此外，1-3组血糖浓度维持在正常水平(< 11.1 mmol/L)， 4组血糖浓度明显升高。小鼠静脉注射RNP2，进行NIR-II荧光成像。从图中肝脏区域的荧光图像来看，2-4组的FL1荧光强度逐渐降低，而1组和5组的FL1荧光仍然较强。此外，从第1组到第4组，FL2/FL1的比值显著升高，表明HClO水平随着糖尿病的持续进展而升高。总之，这些结果表明，基于rnp2的比例荧光成像可以比体重变化至少早1天检测到stz诱导的糖尿病，比血糖检测至少早6天。
作者还研究了糖尿病与肝损伤相关的酶活性之间的关系。正如预期的那样，糖尿病过程导致血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)显著增强，表明肝损伤与糖尿病之间存在正相关。此外，作者对这些小鼠的肝脏进行了组织学分析。与健康小鼠(1组)和治疗组(5组)相比，不同进展阶段的糖尿病小鼠(2 - 4组)均出现炎症细胞浸润和空泡变性，且晚期糖尿病小鼠(4组)损伤较早期糖尿病小鼠(2组和3组)更为严重，提示糖尿病小鼠肝损伤严重。
下肢I/R损伤小鼠模型的比例荧光成像
下肢I/R损伤是骨科手术中常见的主要并发症。I/R损伤常伴有ROS水平过表达。及时测定ROS升高水平对检测I/R损伤程度具有重要意义。本研究采用RNP2实时成像I/R损伤模型中的HClO水平。小鼠右大腿短缺血(30min)或长缺血(60min)，假手术组(小鼠左大腿)为对照组，再灌注90min。图显示了小鼠的I/R过程，假手术组和I/R模型的RNP2为I/R。
在移除血管钳后注射到小鼠体内，然后对小鼠进行NIR-II成像。图像和相应区域的归一化荧光比(FL2/FL1)。假手术组小鼠在注射RNP2后0、60、90 min出现较强的荧光(FL1和FL2)，而缺血组小鼠的FL1较弱。值得注意的是，由于长时间缺血组HClO含量较高，损伤严重，FL1强度低于短时间缺血组。此外，对小鼠下肢切片进行组织学分析。与假手术组相比，I/R损伤区可见炎性细胞浸润，且长缺血(60 min)组损伤较短缺血(30 min)组更严重，提示I/R过程损伤严重。
结论
在这项研究中，开发了一种集成的工程策略来构建基于菁氨酸的NIR-II比率成像纳米平台，该平台在水溶液中表现出明亮的NIR-II荧光，高稳定性和出色的特异性。与游离的NIR-II IR1048染料相比，作者用两亲性聚合物PSMA包覆了疏水的IR1048，构建了PSMA@IR1048 NPs，该NPs在水溶液中表现出明亮和稳定的NIR-II荧光。这种一步自组装方法比通常需要繁琐的合成和纯化的荧光团的直接结构修饰更容易。值得注意的是，PSMA@IR1048 NPs在lps诱导的炎症区域表现出比ICG更稳定的NIR-II荧光。此外，在PSMA@IR1048 NPs表面加载三种基于花青素的荧光团构建NIR-II RNPs，其细胞毒性可以忽略不计，并且具有良好的生物相容性。此外，作者开发了一种电荷调制策略来调整RNPs的反应性，使RNP2具有特定的hcl响应性能。RNP2可以避免疾病部位其他反应性物质的干扰，从而可靠地检测HClO的病理水平。作者注意到，疾病部位HClO水平升高可以破坏RNP2中的识别基团，并产生高比率的NIR-II比率荧光信号(FL2/FL1)。RNP2能够作为一种强大的NIR-II纳米材料，通过对原位HClO的反应，在小鼠模型中检测和成像糖尿病诱导的肝损伤和I/R损伤。作者的研究显示了基于花青素的纳米探针在特定疾病的NIR-II荧光成像中的潜力，并且该策略可能为设计其他明亮和稳定的NIR-II纳米探针用于各种生物学应用提供见解。
参考文献
Engineering of cyanine-based nanoplatform with tunable response toward reactive species for ratiometric NIR-II fluorescent imaging in mice, Yuan Ma, Liuhui Liu, Zhifei Ye, Li Xu, Yuhang Li, Sulai Liu, Guosheng Song, Xiao-Bing Zhang,Sci. Bull. 2023, ISSN 2095-9273. https://doi.org/10.1016/j.scib.2023.08.041.
