内容摘要
苯乙烯染料由于其对环境变化或与大分子结合的强烈荧光响应而成为有用的成像探针和荧光传感器。此前，已有报道称含吲哚的苯乙烯染料可选择性结合核仁和细胞质中的RNA。然而，这些吲哚基染料在细胞成像中的应用受到其适度的荧光增强和量子产率以及与这些绿光发射染料相关的相对较高背景的限制。在这项工作中，我们通过生成吲哚环的区域异构体和等排类似物来研究电子供体的位置和电子效应。选择的探针表现出较大的斯托克斯位移、增强的摩尔消光系数以及吸收和荧光波长的红移。特别是，吲嗪类似物表现出高膜渗透性、结合RNA时的强荧光响应、与荧光寿命成像显微镜（FLIM）的兼容性、低细胞毒性和优异的光稳定性。这些吲嗪染料不仅可以对活细胞中的核仁进行快速、灵敏和强烈的染色，而且还可以解析核仁亚结构，从而能够对核仁形态进行高度详细的研究。此外，我们的染料可以分成 RNA 凝聚层并解决多相复杂凝聚层液滴的形成。这些含吲嗪的苯乙烯探针在文献报道的 RNA 选择性染料中具有最高的荧光增强能力；因此，这些新型染料是市售 RNA 染料 SYTO RNASelect 的绝佳替代品，可用于活细胞和体外的 RNA 可视化。
结果与讨论
染料 1a−1d 的设计与合成。 MPI 和 IN 被用作新型苯乙烯染料设计中的母体化合物。作者采用两种策略来修饰吲哚供体。一种策略涉及保留吲哚供体并改变吲哚环上的取代位置，而另一种策略涉及用其电子等排体吲嗪（另一种富电子芳烃）取代吲哚。这些策略导致设计了 MPI 和 IN 的两种区域异构类似物（1a 和 1b）和两种电子等排类似物（1c 和 1d）。
化合物1a−1d的合成如Scheme 1所示。吲嗪是通过钯催化的2-吡啶丙醇的分子内环化合成的，随后使用基于之前的Vilsmeier-Haack反应将其转化为甲酰基吲嗪中间体（2c和2d）在最后一步中，甲酰基吲哚（2a 和 2b）和甲酰基吲嗪（2c 和 2d）与 N 甲基-4-甲基吡啶发生 Knoevenagel 缩合反应，得到苯乙烯探针 1a−1d。通过 1 H NMR、13C NMR 和 MS对产物进行了表征，所有光谱数据均与提议的化学结构一致。
1a− 1d 的光谱和光物理表征。苯乙烯染料合成后，评估了它们的光物理性质。在 DMSO、T.E. 缓冲液 中测量了探针 1a−1d 的光谱和光物理性质（吸收、发射、摩尔吸收率 (ε)、荧光量子产率 (ΦF) 和荧光增强）。缓冲液（Tris−HCl、1 mM EDTA，pH = 7.5）和 RNA（T.E. 缓冲液中 200 μg/mL）。 1a−1d 的吸收光谱和发射光谱如图所示，其光物理性质总结在表中。
1a− 1d 的光谱和光物理表征
苯乙烯基荧光分子的光物理性质
我们观察到 DMSO 和 T.E 缓冲液中 1a−1d 的吸光度和发射光谱存在轻微的溶剂化显色变化。
这些染料在 DMSO 和 RNA 中比在 T.E.缓冲液中稍微红移。在 T.E.缓冲液中，1a 和 1b 在 422 和 410 nm 处表现出最大吸收波长，并分别以 584 和 568 nm 为中心的宽发射带，表明电荷转移激发态。 1a 和 1b 的吸收和发射波长略有不同，与两种类似物之间的细微结构和电子差异一致。染料 1a 和 1b 表现出 162 和 142 nm 的大斯托克斯位移，摩尔吸光系数值为 20,600 和 24,400 M−1 cm−1 。正如预期的那样，溶液中游离染料的荧光量子产率较低（1a 和 1b 为 0.12%），这与苯乙烯染料通过旋转耗散能量从而导致非辐射弛豫至基态的能力一致。区域异构体 MPI 和 1a 的光物理性质的直接比较表明，两种染料具有相似的吸收波长，而 1a 的发射波长与 MPI 相比明显红移（> 50 nm）。观察到的吲哚区域异构体光物理性质的差异可以通过电子如何穿过苯乙烯染料的两种共振形式之间的共轭π系统来解释。这种定性分析表明，1a 和 1b 内的电子转移跨越了比 MPI 更大的共轭 π 系统。因此，2-吲哚衍生物的共轭π-系统参与电子转移的程度高于3-吲哚衍生物的共轭π-系统。这可能解释了与 MPI 相比观察到的 1a 和 1b 发射的红移。
吲嗪染料 1c 和 1d 在吸收（510 和 486 nm）和发射（596 和 572 nm）波长上均显示出显着的红移。经历电子运动的共轭π-系统之间的尺寸差异可以解释所观察到的吲嗪染料的红移。染料 1c 和 1d 显示出窄发射带和中等溶剂化变色效应，这支持发射发生在局部激发态。1c 和 1d 显示出 86 nm 的大斯托克斯位移以及 27,500 和 34,600 M−1 cm−1 的摩尔吸光系数值.正如预期的那样，T.E. 中游离染料的荧光量子产率缓冲液较低，1c 和 1d 的值分别为 0.10 和 0.38%。
1a−1d 对 RNA 的体外荧光响应。为了确定 RNA 存在下 1a-1d 的荧光变化，我们将染料 (10 μM) 与圆酵母 IV 型 RNA 在 T.E. 中孵育。缓冲并测量如上所述的光谱和光物理参数。通过计算 RNA 溶液中染料与游离染料的量子产率之比来计算倍数增强值。染料 1a 和 1b 的荧光增强分别为 83 倍和 33 倍，量子产率分别为 9.9% 和 3.9%。虽然 1a 与 MPI 相比显示出相似程度的荧光增强，但 1b 仅显示出 33 倍的荧光增强，大约是观察到的 MPI 荧光增强的一半。该数据表明，吲哚氮上的甲基取代基可以提高量子产率，这可能是由于甲基赋予的电子供给效应。
添加 RNA 后，吲嗪染料 1c 和 1d 的荧光强度显着增加，绝对量子产率为 49% 和 50%。作者观察到吲嗪染料 1c 和 1d 的荧光强度显着增强了 490 倍和 132 倍。1c 和 1d 对结合 RNA 的响应。值得注意的是，含吲嗪染料（1c 和 1d）的量子产率和荧光响应远高于含吲哚染料（1a、1b 和 MPI）。当 1c 与 DNA 一起孵育时，它产生的荧光响应比与 RNA 一起孵育的染料低，这表明在体外，RNA 相对于 DNA 具有适度的选择性。与相同的 RNA 种类一起孵育后，1c 表现出比与 RNA 一起孵育的染料更高的荧光响应SYTO RNASelect。此外，作者证实 1c 可以对 PAGE 凝胶中的 RNA 进行染色，尽管其灵敏度低于商业标准 SYBR Gold。作者推测 1c 的尺寸比商业花菁染料（例如 SYBR Gold）更小，这可能是其在体外对凝胶中的 RNA 进行染色时灵敏度相对较低的原因。鉴于 1c 和 1d 在我们的苯乙烯染料中显示出最有利的光谱和光物理品质，作者选择在后续的体外和细胞成像实验中进一步表征这些吲嗪染料。
使用 1c 和 1d 进行活细胞和固定细胞成像。为了确定 1c 和 1d 的细胞定位，在图像采集之前，用 20 μM 的任一染料将活 HeLa 细胞染色 30 分钟。 1c 和 1d 的荧光信号主要在核仁和细胞质内可见，而细胞核则呈深色，这与染料与 RNA 的优先结合一致。 1c 和 1d 的定位与 MPI 染色的 HeLa 细胞相似。使用 1c 或 1d 获得的 HeLa 细胞图像的强度和对比度明显高于 MPI，这与使用吲嗪染料观察到的更高量子产率和倍数增强一致。在更高的放大倍数下观察 1c 的荧光图像，作者观察到分布在整个细胞质中的可区分的纤维状结构，类似于线粒体染色图。这可以通过 1c 的亲脂性、阳离子特性来解释，由于线粒体膜电位为负，它允许在线粒体中积累，类似于已建立的线粒体染料（例如 MitoView 和 MitoTracker）。这些结构作为线粒体的有效性我们的动态成像数据进一步证实了它们在细胞质内的运动。
染料在活细胞核仁成像方面表现出出色的动力学和灵敏度。在培养基中添加 1c 或 1d 后 30 秒就可以清楚地辨别出核仁，而即使按照制造商的方案孵育 30 分钟，也无法检测到来自 SYTO 的信号。剂量反应研究表明，纳摩尔浓度的 1c 足以观察活 HeLa 细胞中的核仁。将细胞与较高浓度的 SYTO 一起孵育会产生染料聚集体，可以将其视为培养基中的明亮液滴。
为了确定染料 1c 和 1d 在固定条件下是否显示相似的定位特征，在用任一染料染色之前用 4% 多聚甲醛 (PFA) 固定 HeLa 细胞。我们发现 1c 和 1d 显示出与活细胞成像观察到的定性相似的标记模式，荧光信号主要来自核仁和细胞质。正如预期的那样，固定消除了线粒体膜电位，并且细胞质中不存在染色的纤维状外观。通过用 RNase 处理固定 HeLa 细胞的实验，证实 1c 的核仁染色是 RNA 依赖性的。此外，用 SYTO 和 1c 共染色 HeLa 细胞导致两种染料在核仁中共定位。
为了评估探针 1c 和 1d 的复染兼容性，作者用 1c 或 1d 以及 Hoechst 33342 对 HeLa 细胞进行染色。正如预期的那样，在核仁和细胞质结构内可以清楚地看到来自染料的荧光信号，而 Hoechst 33342 信号仅限于细胞核内。数据表明，1c，1d 和 Hoechst 33342 的荧光信号是不同的，并且两种类型的染料在共染色实验中是兼容的。
作者研究了吲嗪染料是否可以解析核仁的亚结构。从形态学上讲，核仁分为纤维中心 (FC)、致密纤维成分 (DFC) 和外颗粒成分 (GC)，它们在核糖体生物合成中具有不同的功能。核仁的放大图像清楚地表明 1c 能够通过荧光显微镜揭示不同的亚核仁区域。图像显示 GC 被 1c 强烈染色，而 FC 和 DFC 在核仁内出现同样暗淡的空腔。这些观察结果可归因于核仁亚结构内存在 RNA。 GC 富含 rRNA 和核糖体蛋白，含有核糖体前亚基，而 FC 含有浓缩 rDNA 染色质簇。使用 1c 获得的荧光图像通过透射相差得到证实，其中核仁结构可以被辨别，尽管具有较低的分辨率。分辨率。这些数据表明 1c 可用于可视化和研究活细胞和固定细胞中的亚核仁结构和核仁形态。
为了进一步表征染料在细胞中的特征，作者进行了荧光寿命成像显微镜（FLIM）来研究染料是否在细胞中表现出独特的荧光寿命。作者观察到 1c 的四种不同的荧光寿命种类，具体取决于其亚细胞位置：核仁 (3.4 ns)、细胞核 (2.5 ns)、细胞质 (1.6 ns) 和未结合的染料 (0.82 ns)。利用相量方法进行 FLIM 分析，因为它提供了强大的无拟合工具，可以通过带有成像数据的图形界面来表征和显示染料微环境的差异。显示了强度的并排比较，基于 FLIM 相量掩模的图像，突出显示了亚细胞 RNA 阳性微环境的差异。像 1c 这样的染料具有独特且可分离的寿命，是区分由相同染料染色的多个含 RNA 结构以及监测这些位置的含 RNA 结构动态的宝贵工具。这些数据表明 FLIM 可以提供第二个维度来区分由相同吲嗪染料染色的不同细胞结构。
细胞毒性和光稳定性。通过使用 HeLa 细胞进行 MTT 测定来评估 1c 和 1d 的细胞毒性。将细胞与浓度范围为 0.1 至 30 μM 的每种染料一起孵育 24 小时。我们的结果表明，用 30 μM 1c 或 1d 孵育 24 小时后，>70% 的细胞仍然存活。因此，这些含吲嗪的探针对于短期成像实验来说基本上是无毒的。值得注意的是，细胞毒性是由荧光标记的细胞反复或长时间暴露于高激光功率的照射引起的。过度暴露于照射的细胞可能会对大分子和细胞器造成损害，从而对细胞活力产生负面影响。多项研究报告称，由于细胞死亡发生率较低，红移染料优于较短波长染料（例如紫色或蓝色激发）。为了最大限度地减少毒性，必须考虑几个因素：染料浓度、激光功率和激发波长。在作者的研究中，确定 1c 可以在低至 10 nM 的浓度下使用来解析核仁，而 SYTO RNASelect 需要更高的浓度 (>2 μM) 才能看到荧光信号。此外，1c 良好的光物理特性（例如高量子产率）允许使用低激光功率轻松获取高对比度活细胞图像，而 SYTO 无法实现这一点。最后，与 SYTO 相比，1c 和 1d 的激发波长相对更红移。较长的激发波长具有许多优点，包括减少光漂白、增加组织穿透性和减少自发荧光。
作者与 SYTO 相比评估了染料的光稳定性。将固定的 HeLa 细胞与 1 μM 1c、1d 和 SYTO 一起孵育 30 分钟，并彻底清洗以去除多余的染料。将细胞暴露在固定激光功率下的连续照射下，并在一系列不同时间点进行成像。定量分析了每个时间点的荧光强度，并确定 1c 和 1d 显示出明显更高的光稳定性，半衰期 (t1/2) 约为 13 分钟。相比之下，SYTO 的 t1/2 约为 1.5 分钟，比 1c 和 1d 的 t1/2 小 8 倍以上。这些结果表明 1c 和 1d 适用于较长的成像实验，而不会出现光漂白问题。
使用 1c 检测 RNA 凝聚层。液-液相分离 (LLPS) 已成为细胞过程研究的新范例。LLPS 被认为是形成细胞内无膜细胞器 (MLO)（例如核仁和 P 颗粒）的潜在机制。研究这些 MLO 可以深入了解疾病的分子基础。因此，研究工作集中于了解它们的形成，以便进一步研究各种生物过程和系统的生理学和病理生理学。最常用的方法最初检测 LLPS 的方法是显微镜。因此，使用荧光标记的冷凝物成分可以实现体外和细胞内的检测。先前的研究利用荧光标记的 RNA、肽和蛋白质来可视化 RNA 凝聚层，这是一种由 LLPS 形成的液滴。然而，这些策略需要用荧光素和 GFP 等外源荧光团修饰 RNA 和工程蛋白质。鉴于 1c 在结合 RNA 时表现出显着的荧光反应，我们假设 1c 可以富集和标记 RNA 凝聚层。为了测试这一点，我们按照适当的程序设计了一个由圆酵母 RNA（阴性聚电解质）和精胺（阳性聚电解质）组成的简单体外模型。将凝聚层与 1c 一起孵育，并使用共聚焦荧光显微镜和 FLIM 进行成像。
作者观察到在高离子强度缓冲液中混合 RNA 和精胺溶液时形成球形凝聚液滴。使用共焦荧光显微镜和 FLIM 对与 1c 一起孵育的凝聚层进行可视化。强度和 FLIM 图像均显示 1c 很容易分割成 RNA 凝聚层，并在 RNA 密集浓缩的情况下表现出强烈的荧光信号。作者将此归因于 1c 的阳离子和亲脂性质，有利于疏水性和缺水区域的积累，而强荧光响应是由于探针与 RNA 结合时旋转自由度降低所致。相量图表明存在均匀分散在整个凝聚层中的单一荧光寿命物质。除了均匀的凝聚层液滴外，由于电荷-电荷相互作用和临界盐浓度驱动的大分子密度存在足够的差异，在这些条件下也会形成多相复杂凝聚层。有趣的是，FLIM 可以更好地解析多相复杂 RNA 凝聚层（空腔-包含液滴）比基于强度的成像。共存相中的不同层呈现出不同的化学环境，可以不同程度地浓缩 1c 或其他客体分子。我们推测图 7 中观察到的空腔是一个高度溶剂化的区域，其中荧光信号由于非辐射衰减而被猝灭。需要进一步的实验来充分表征每个相的化学环境。
结论
总之，作者开发了一组荧光苯乙烯染料，用于可视化活细胞和 RNA 凝聚层中的 RNA。鉴于 MPI 之前已表现出良好的细胞渗透性和 RNA 选择性，但仅表现出中等的荧光增强和量子产率，作者试图生成 MPI 类似物，以改善其光谱和光物理特性，同时保留其对细胞中 RNA 的选择性。通过改变吲哚供体上的取代位置并用吲嗪取代吲哚，作者合成了四种新型苯乙烯染料 1a−1d，它们表现出显着改变的光谱和光物理特征。染料 1a 和 1b 只是 MPI 的区域异构体，但它们在发射波长中显示出 >20 nm 的红移，并且斯托克斯位移明显大于 MPI。吲哚供体从 3 位到 2 位的位置变化呈现出一种改变的电子构型，涉及染料支架的共轭 π 系统中更大的面积，从而降低了分子的总能量。除了发射波长显着红移之外，染料 1a 和 1b 平均表现出比 MPI 更低的摩尔吸光率和量子产率值。尽管 1a 观察到出色的 83 倍荧光增强，但由于其低量子产率，其实用性受到限制。
相反，当吲哚供体被吲嗪取代时，所得含吲嗪的染料不仅在光谱性质上而且在光物理性质上都表现出改善。人们发现这些染料在可见光谱的红色区域吸收和发射，使它们更适合细胞和组织成像。此外，1c和1d在结合RNA时表现出高量子产率和显着的荧光增强。我们推断，供体替换导致电子转移中的共轭扩展，从而降低了系统的总能量——与 1a 和 1b 中观察到的情况类似。目前正在进行严格的计算研究，以解释在这些苯乙烯染料中吲嗪相对于吲哚的优越性能，并将很快得到报告。
吲嗪是一种含氮杂环，在药物化学和制药中具有多种用途。最近，吲嗪已被探索在荧光和发光材料中的应用，特别是在有机发光二极管 (OLED) 中，因为它们具有高量子效率产量和可调荧光特性。作者的研究将吲嗪部分纳入苯乙烯支架中，用于标记活细胞中的 RNA。我们的数据验证了吲嗪优异的光物理性质，特别是与其吲哚电子等排体相比。据作者所知，这项研究代表了这种有趣的杂环在用于活细胞标记的 RNA 选择性染料中的首次应用。
作者已经证明 1c 和 1d 与活细胞和固定细胞成像实验兼容，并且可以解析亚核仁结构，例如来自周围 GC 的 FC。此外，染料已用于捕获动态细胞过程，包括线粒体运输和细胞凋亡。 Hoechst 33342 的共染色实验表明，染料与核染色剂兼容，并且可能与其他细胞器特异性染料兼容。数据表明，1c 和 1d 确实以高灵敏度、快速标记动力学、高对比度和低背景标记富含 RNA 的核仁。观察到核仁中 SYTO 和 1c 的共定位信号，表明这两种染料都与富含 RNA 的核仁相关。然而，没有在周围的细胞核中观察到荧光信号，这表明 1c 和 1d 不通过嵌入或小沟结合与染色体 DNA 结合。尽管这些苯乙烯染料与RNA结合的确切机制尚未阐明；根据观察，假设 1c 和 1d 在结合 RNA 时可能不会充当经典的嵌入剂或小沟结合剂。为了进一步改进这些染料，必须努力阐明这些染料与 RNA 的确切结合模式。
除了基于细胞的成像之外，还证明染料可以在体外选择性地分离和标记 RNA 凝聚层。开发可以选择性地在凝聚层中积累的小分子探针有助于研究 LLPS，并且可以作为描绘 RNA 凝聚层功能的关键工具。细胞中的生物分子凝聚体及其生理和病理生理作用。
作者的染料具有良好的光稳定性且无细胞毒性，使其可用于长期、时间分辨成像实验。 1c 和 1d 优异的量子产率无需使用高激光功率照射染料，从而降低光毒性的发生率。鉴于我们的染料具有高灵敏度，低至 10 nM 的浓度已成功用于解析核仁。作者的染料在不同的细胞和水环境（即核仁、细胞核和细胞质）中显示出独特的荧光寿命，允许根据荧光寿命进行选择性成像。设想染料能够作为 FLIM 实验的优秀探针，以解析荧光强度和发射波长之外的细胞结构。事实上，无论光谱重叠如何，作者的染料甚至可以与其他红色染料 (λem > 580 nm) 兼容。鉴于新型吲嗪染料具有优异的荧光特性，相信它们可以在各种细胞成像研究中作为 SYTO RNASelect 的更好替代品。最后，作者的目标是扩大这些 RNA 选择性荧光染料的效用和应用。目前的努力旨在通过将额外的电子供体和受体整合到苯乙烯支架上来扩展我们的苯乙烯染料库。此外，作者的目标是整合能够选择性结合特定序列的 RNA 种类的化学部分。
参考文献
Development of Highly Fluorogenic Styrene Probes for Visualizing RNA in Live Cells. Moon Jung Kim, Yida Li, Jason A. Junge, Nathan K. Kim, Scott E. Fraser, and Chao Zhang. ACS Chem. Biol. 2023, 18, 1523−1533，https://doi.org/10.1021/acschembio.3c00141
