内容提要
快速准确的术中病理诊断(IOPD)对术中决策、改善患者预后、避免再次手术至关重要。本研究利用NAD(P) H激活的荧光探针，开发了一种多功能荧光指示剂，可选择性识别正常组织中的肿瘤细胞，实现肿瘤分级鉴定。这种快速反应探针CyQ-1在生理条件下对低纳摩尔水平的NADH具有前所未有的灵敏度和快速反应。此外，该指示剂可在HeLa、A549、MDA-MB-231、4T1、MCF-7、HePG2、HUVEC和HL-7702细胞中进行NADH比色和荧光检测。将该指标扩展到高级组织模型，进一步验证了其在120例结直肠癌石蜡包埋切片和20例肺癌术中冷冻切片中显示NADH的能力。基于CyQ-1的肿瘤分级鉴定与石蜡切片和冷冻切片的组织学分级“金标准试验”的一致性分别为92.5%和100%。对低分化、中度分化和高分化肿瘤切片的敏感性和特异性均在90%以上。总之，临床切片快速准确的检测NADH的能力使该指标成为临床IOPD量化和肿瘤分化分级识别的潜在候选指标。
结果
CyQ-1指示剂的设计与合成
由于细胞中存在多种细胞器和物质，因此设计具有前所未有的选择性和灵敏度的NAD(P)H快速准确可视化的可靠探针是非常复杂的。由于其高稳定性、优越的光物理特性和多细胞器靶向能力，花青素染料被认为是设计NAD(P)H探针的一个有吸引力的平台。此外，喹诺啉有一个缺电子杂环，众所周知，它可以与NAD(P)H类似物发生双电子还原反应。在这些优点和特点的启发下，本文设计了两种NAD(P)H指示剂，通过聚甲基链将菁菁染料与喹啉相连。设计的指示剂CyQ-1和CyQ-2具有典型的π共轭受体-受体(a−π-A)体系。探针与NAD(P)H反应后，氢化物从NAD(P)H转移到喹啉的受体模块，将NAD(P)H指示剂的能量传递体系从A-π-A体系转变为新的A-π-D体系。反应机理与前人报道的NAD(P)H指示剂一致。因此，在紫外和荧光光谱中可以观察到明显的色移和明显的荧光增强。CyQ-1的荧光响应随着NADH浓度的增加呈线性增加，直到在约14 μM处达到饱和，在583 nm处荧光信号强度增加了近10倍。CyQ-1和CyQ-2的合成遵循Knoevenagel反应方案进行。NAD(P)H指示物(CyQ-1和CyQ-2)和反应中间体无需色谱纯化步骤即可方便合成。最终产物通过1H NMR、13C NMR、质谱和UV-vis光谱进行表征。
指示剂CyQ-1的传感特性
在哌嗪-N, N ' -双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中，在25°C下对CyQ-1及其对NADH的响应进行光谱评价。纯CyQ-1探针(20 μM)在环境光下的溶液中呈现淡黄色，吸收峰微弱且宽，以372 nm为中心。然而，NAD(P)H的加入使探针溶液呈现出视觉上可识别的紫红色，在室温下稳定数小时。同时，随着NADH浓度的增加，出现了以559 nm为中心的新吸收峰，吸收峰强度增强。此外，发射光谱也证实，添加NADH后，CyQ-1探针的荧光信号明显增强，在浓度为14 μM时，发射信号增强了10倍。这种现象的机理可以用先前报道的喹啉基团向二氢衍生物(CyQ-1H)形式的结构转变来解释。(35)从图的时程结果来看，荧光信号在5 min内达到饱和，表明探针对NAD(P)H的反应速度很快，这对临床IOPD至关重要。荧光滴定实验表明，该探针对PIPES缓冲液中NAD(P)H的检测具有高度的线性响应(R2 = 0.995)。利用回归方程(3σ/k)计算出CyQ-1对NADH的检出限为13.2 nM，记录了583 nM的发射强度。在500 nm处，CyQ-1对NADH浓度(0 ~ 30 μM)升高的荧光响应表明，CyQ-1具有13.2 nm ~ 14 mM的较宽检测范围，是IOPD和组织学分级的理想生物探针。此外，还测定了该指示剂的量子产率。在NADH (0 ~ 30 μM)存在下，CyQ-1的量子产率从2.11%提高到65%，在583 nm处发射信号的量子产率提高了约30.8倍。与CyQ-1一样，乙基取代的CyQ-2对NADH的检测表现出类似的光学性质。同时，CyQ-1H具有较高的摩尔消光系数(λmax = 583 nm， ε = 7.4 × 104 M-1·cm-1)。
选择性是荧光探针用于细胞检测之前必须考虑的一个关键参数。CyQ-1的发射响应不受其他生物相关因子如Na+、K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Fe2+、丙酮酸盐、葡萄糖、果糖、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、氧化谷胱甘肽和NAD+的干扰，表明CyQ-1对NAD(P)H具有高度的化学选择性。虽然CyQ-1对谷胱甘肽确实表现出积极的反应，但与NAD(P)H相比，CyQ-1与谷胱甘肽的反应时间明显更长。因此，在较短的检测过程中，不会对NAD(P)H的检测结果产生显著影响。此外，pH对CyQ-1与NADH的氧化还原反应影响较小，CyQ-1探针在生理pH范围内具有超高的NAD(P)H传感活性。与CyQ-1相比，细胞成像实验显示CyQ-2的光稳定性较差，这可能是由于CyQ-2具有更好的水溶性。综上所述，CyQ-1具有快速的动力学特征、极低的检出限、良好的稳定性和特异性，可为活细胞和固定切片中的NADH提供专门的定量信息。
在哌嗪-N, N ' -双(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲液中，在25°C下对CyQ-1及其对NADH的响应进行光谱评价。纯CyQ-1探针(20 μM)在环境光下的溶液中呈现淡黄色，吸收峰微弱且宽，以372 nm为中心。然而，NAD(P)H的加入使探针溶液呈现出视觉上可识别的紫红色，在室温下稳定数小时。同时，随着NADH浓度的增加，出现了以559 nm为中心的新吸收峰，吸收峰强度增强。此外，发射光谱也证实，添加NADH后，CyQ-1探针的荧光信号明显增强，在浓度为14 μM时，发射信号增强了10倍。这种现象的机理可以用先前报道的喹啉基团向二氢衍生物(CyQ-1H)形式的结构转变来解释。从图的时程结果来看，荧光信号在5 min内达到饱和，表明探针对NAD(P)H的反应速度很快，这对临床IOPD至关重要。荧光滴定实验表明，该探针对PIPES缓冲液中NAD(P)H的检测具有高度的线性响应(R2 = 0.995)。利用回归方程(3σ/k)计算出CyQ-1对NADH的检出限为13.2 nM，记录了583 nM的发射强度。在500 nm处，CyQ-1对NADH浓度(0 ~ 30 μM)升高的荧光响应表明，CyQ-1具有13.2 nm ~ 14 mM的较宽检测范围，是IOPD和组织学分级的理想生物探针。此外，还测定了该指示剂的量子产率。在NADH (0 ~ 30 μM)存在下，CyQ-1的量子产率从2.11%提高到65%，在583 nm处发射信号的量子产率提高了约30.8倍。与CyQ-1一样，乙基取代的CyQ-2对NADH的检测表现出类似的光学性质。同时，CyQ-1H具有较高的摩尔消光系数(λ max = 583 nm， ε = 7.4×104 M-1·cm-1)。
选择性是荧光探针用于细胞检测之前必须考虑的一个关键参数。CyQ-1的发射响应不受其他生物相关因子如Na+、K+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、Fe2+、丙酮酸盐、葡萄糖、果糖、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、氧化谷胱甘肽和NAD+的干扰，表明CyQ-1对NAD(P)H具有高度的化学选择性。虽然CyQ-1对谷胱甘肽确实表现出积极的反应，但与NAD(P)H相比，CyQ-1与谷胱甘肽的反应时间明显更长。因此，在较短的检测过程中，不会对NAD(P)H的检测结果产生显著影响。此外，pH对CyQ-1与NADH的氧化还原反应影响较小，CyQ-1探针在生理pH范围内具有超高的NAD(P)H传感活性。与CyQ-1相比，细胞成像实验显示CyQ-2的光稳定性较差，这可能是由于CyQ-2具有更好的水溶性。综上所述，CyQ-1具有快速的动力学特征、极低的检出限、良好的稳定性和特异性，可为活细胞和固定切片中的NADH提供专门的定量信息。
葡萄糖、乳酸、丙酮酸和鱼藤酮刺激下NADH的体外检测
在探索使用CyQ-1成像活细胞中NADH的可行性之前，我们首先评估了CyQ-1对A549、HeLa和HUVEC细胞的细胞毒性。无论在哪个细胞系，CyQ-1都表现出良好的生物相容性。值得注意的是，60 μM CyQ-1孵育24 h后，HeLa和A549细胞的细胞活力仍保持在80%以上，确保了其进一步的生物成像应用。细胞器特异性共定位研究采用共定位方法，使用Mito-Tracker Green、Lyso-Tracker Green和DAPI (4′，6-二氨基-2-苯基吲哚，一种与DNA结合的荧光染色剂)作为染色探针在A549细胞上进行。用Mito-Tracker Green、Lyso-Tracker Green和CyQ-1染色的A549细胞分别在绿色和红色通道中显示出强烈的发射。与Lyso-Tracker green和Mito-Tracker green的Pearson’s共定位较好(P = 0.88和0.90)，与DAPI的Pearson’s共定位较差(P = 0.43)，说明CyQ-1主要分布在A549细胞的细胞质中。对CyQ-1的细胞内光稳定性也进行了探讨。图S16显示了CyQ-1和Mito-Tracker绿色在可见光(绿色通道:465-495 nm，红色通道:525-570 nm 连续照射60 s后的稳定性。与Mito-Tracker Green相比，CyQ-1即使在照射60s后也几乎保持恒定的荧光发射强度。图所示的时间依赖性荧光成像显示，CyQ-1能在10 min内与活的A549细胞中的NADH快速反应。
CyQ-1的快速动力学特征、对NADH的高化学选择性和良好的光稳定性使其能够进一步应用于监测NADH依赖性酶及其底物在活细胞中的活性。为了更好地说明上述传感能力，我们使用CyQ-1分析外源添加葡萄糖、乳酸、丙酮酸和鱼藤酮刺激下细胞内NADH的表达水平。葡萄糖对NADH表达水平的影响首先在葡萄糖脱氢酶(GDH)的参与下进行检测。
GDH催化β-d-葡萄糖氧化为β-d-葡萄糖-1,5-内酯，同时辅因子NAD+还原为NADH。由此产生的还原辅因子随后与CyQ-1反应，导致CyQ-1H的形成和荧光发射增加。葡萄糖(5 mM, 10 mM)预处理30 min后，A549细胞荧光信号明显增强。流式细胞术定量评价A549细胞NADH代谢对葡萄糖刺激的反应。如图3B所示，没有葡萄糖孵育的对照组的荧光强度较低，而5 mM、10 mM葡萄糖和CyQ-1 (10 mM)处理的A549细胞样品的荧光强度分别增加到约10660和50915。结果证明，CyQ-1能灵敏地分辨葡萄糖诱导的细胞内NADH波动。
乳酸和丙酮酸一起作为循环氧化还原缓冲液，平衡细胞和组织之间的NAD+/NADH比率。乳酸和丙酮酸的失衡极大地影响了活细胞中NADH的水平。在癌细胞中，过度活跃的糖酵解产生的过量丙酮酸将在发酵过程中转化为乳酸。在这种转化中，乳酸脱氢酶(LDH)消耗两个等效的NADH分子，通常称为厌氧糖酵解。因此，我们利用CyQ-1研究过量丙酮酸和乳酸对NADH水平波动的影响。如图3C所示，外源性乳酸(5和10 mM)孵育A549细胞后，由于乳酸转化为丙酮酸，细胞内NADH水平上调，导致红色通道荧光强度稳步增加。相比之下，丙酮酸处理的A549细胞的荧光信号随着丙酮酸浓度从0到5 mM的增加而逐渐降低。流式细胞术结果显示，乳酸和丙酮酸对NADH代谢事件的影响完全相反。以上结果验证了CyQ-1可以监测乳酸-丙酮酸相互转化诱导的NADH表达变化。
进一步研究了NADH在线粒体氧化磷酸化中的作用。鱼藤酮是一种众所周知的呼吸复合物I抑制剂，据报道可降低细胞NAD+/NADH比值。当鱼藤酮阻断线粒体呼吸链的氧化过程时，NADH氧化被阻止。随着鱼藤酮的加入，A549细胞的荧光强度逐渐增强，流式细胞术结果也证实了这一点。我们通过将HL-7702、HUVEC、HepG2和4T1分别用5 μM和10 μM的NADH孵育，进一步验证了CyQ-1对已知水平NADH的细胞反应。在孵育过程中，四种不同细胞类型的荧光强度随着NADH浓度的升高而增加。以上证据表明，CyQ-1非常适合用于生物系统中快速、灵敏的NADH检测。
为了验证该方法区分肿瘤细胞和正常细胞的通用性，我们利用CyQ-1检测了不同细胞系(包括2个正常细胞和4个肿瘤细胞)的NADH水平。为了更好地说明NADH的表达差异，将正常、高分化、中分化和低分化细胞对应的HUVEC、HL-7702、HepG2、MCF-7、4T1和MDA-MB-231细胞(40个)分别用CyQ-1 (10 μM)染色30 min。图4A共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示，CyQ-1可以染色不同细胞的细胞质，不同细胞系的荧光强度也不同。为了进行更清晰的定量比较，使用从红色通道记录的平均荧光强度(MFI)来量化NADH水平。所有MFI水平均为冷冻切片的平均荧光强度。HUVEC和HL-7702细胞系荧光强度较弱(MFI分别为4420和4823)，说明NADH表达水平较低。
而HepG2细胞系的荧光细胞图像显示，其荧光强度(MFI = 4926)高于HUVEC和HL-7702细胞系，这是HepG2细胞系分化良好的原因。此外，对于MCF-7细胞系，MFI值增加到5244，远远高于HepG2细胞系，这主要归因于MCF-7是一种更恶性的细胞系。由于4T1和MDA-MB-231是低分化细胞，因此在4T1和MDA-MB-231细胞(MFI = 5512和6529)中观察到显著的荧光发射，表明NADH的表达水平最高。作为对照实验，我们使用商业化的NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8)来评估NADH在不同细胞系中的表达水平。从图中可以明显看出，HL-7702和HUVEC细胞系都是正常细胞系，NADH水平相对较低。相反，中等分化的HepG2细胞与先前的正常细胞相比显示出更高的NADH水平。值得注意的是，低分化的4T1细胞系显示出最高的NADH水平，超过30 pmol。结果与指标CyQ-1的检测结果一致。因此，CyQ-1能够通过平均荧光强度成功区分不同分化程度的细胞，确保了其在进一步的临床应用。为进一步证实CyQ-1在肿瘤细胞中检测NADH的能力，采用流式细胞术对相应细胞的荧光强度进行复核。4T1和MDA-MB-231细胞的MFIs均在15000以上，远高于其他4个细胞系，说明两种低分化肿瘤细胞4T1和MDA-MB-231的NADH表达水平最高。由于MCF-7为中分化肿瘤细胞系，其MFI值(13535.12)低于4T1和MDA-MB-231。流式细胞术分析显示，与前三种肿瘤细胞系相比，分化良好的肿瘤细胞HePG2的MFI明显降低。因此，通过比较肿瘤细胞的荧光信号强度，可以很容易地将肿瘤细胞分为低分化、中等分化和高分化三种类型。相比之下，两个正常细胞，HUVEC和HL-7702，在红色通道中显示出较暗的辐射。这些结果与荧光显微镜图像的结论一致。
120个结直肠石蜡切片NADH水平的具体诊断数据，包括CyQ-1的MFI, DAPI染色切片，MFICyQ-1/MFIDAPI比值。30个低分化肿瘤切片的总体MFI值在39400以上，30个中度分化肿瘤切片的MFI值在23 000 ~ 42 000之间。对于分化良好的切片，30个标本的MFI与正常组织的差异很小，约为11 000 - 30 000。高分化切片与正常组织间的MFI差异明显。正常组织的平均MFI在6000以下。
接下来，我们试图实现特定的阈值间隔，以区分特定的标本，从一组差，中等，和良好分化的切片和正常组织。描述性统计提供了有关频率、平均值和置信区间(95% CI)的信息。对于低分化切片，使用48 894和66 912之间的MFI (95% CI)作为阳性判定的最佳阈值区间。可见，30例低分化结直肠肿瘤样本中，NADH水平检测阳性的正确率为28例，敏感性为93.3%，误诊率为2例。对于中度分化切片，30个中有29个与其他分化切片正确识别，灵敏度为96.7% (95% CI = 23 894-43 180)。与之前的结果相比，分化良好的标本显示出相对较低的灵敏度。在这种情况下，30个样本中有4个超出了合理范围，灵敏度为86.7%。这种低敏感性的一个主要原因是，与正常组织相比，分化良好的肿瘤切片具有相似的H&E外观，这导致临床病理学家的诊断错误。总体而言，手术石蜡标本中肿瘤分化等级识别(不包括正常组织)的总准确率为92.2% 。
考虑到临床实验室使用的荧光显微镜种类繁多，为了给结直肠肿瘤病理诊断建立统一的检测标准，选择比值值作为区分差、中、高分化切片的最佳阈值。29/30(97%)低分化切片呈阳性，比值区间为1.64 ~ 4.01,30/30(100%)中分化切片呈阳性，比值区间为1.17 ~ 2.24。高分化肿瘤切片和正常组织，28/30(93%)和29/30(97%)切片分别位于0.60-1.26和0.16-0.45区域。
应用以往的MFI阈值区间时，肿瘤总切片的敏感性和特异性均在90%以上。MFI与比值阈值的对比分析显示，低分化、中等分化和高分化标本的NADH水平差异有统计学意义。正如预期的那样，通过MFI和比值阈值，我们可以很容易地将结直肠肿瘤标本区分为特定的分化等级。
综上所述，这些研究表明CyQ-1可以通过定量检测NADH水平来区分结直肠肿瘤的分级。虽然中度分化和高分化肿瘤切片的阈值间隔部分重叠，但CyQ-1在区分肿瘤分化等级方面仍有明显优势。考虑到石蜡切片在临床术中诊断并不常见，我们想知道CyQ-1对术中冷冻切片诊断是否具有预测价值。
NADH对IOPD的原位成像
由于设计的CyQ-1在石蜡切片中对细胞内NADH具有优越的传感性能，因此随后开展了将CyQ-1用于术中冷冻切片分析的研究。冷冻切片被广泛用于IOPD，这是公认的最常用的术中诊断方法。与石蜡切片相比，冷冻切片不需要蜡浸润的过程，使其对IOPD的反应更加迅速。考虑到术中诊断的时效性要求，术中病理分析要求在几十分钟内完成。CyQ-1染色作为一种小分子探针，检测NADH快速、方便、准确，更适合于术中快速病理分析。
本研究选取15例肺癌患者和5例健康供体标本进行NADH分析。每个样品制备两个冷冻切片，一个用于CyQ-1, DAPI染色，另一个用于H&E染色。尽管两张切片来自同一组织，但H&E和CyQ-1染色的图像显示出轻微的差异。对染色组织切片进行定量分析，所有肿瘤切片的荧光强度均高于正常组织。其中，在冷冻切片中，5个低分化肿瘤切片的MFI相对较高，从33 441到49 855，而5个中分化肿瘤切片的平均MFI约为23 000。与正常组织相比，高分化肿瘤切片的MFI值在8909 ~ 14 193之间，与结直肠癌高分化肿瘤石蜡切片相似。
为了消除环境因素的影响，提高比较的准确性，我们还计算了红色通道(CyQ-1)和蓝色通道(DAPI)的MFI进行病理分析。低分化肺癌的MFICyQ-1/MFIDAPI值分布在1.63 ~ 2.49之间。而5例中分化肺癌对应的荧光图像中，红色通道荧光信号较弱，平均比值约为1.13。对于分化良好的切片和正常组织，比值低于0.87。对于术中病理分析，我们通过统计分析肺癌患者手术标本的MFI值，确定了四个阈值区间，可用于定义正常、良好、中度和低分化肿瘤。根据图6B和表S2对MFI的统计结果，对MFI进行描述性分析的结果总结如下:用27 143-53 611 (95% CI)或1.18-2.61 (95% CI)的MFI作为鉴别低分化切片的最佳区间，用21 009-26 494 (95% CI)或0.99-1.27 (95% CI)的MFI作为鉴别中分化切片的最佳区间。与石蜡切片不同，高分化冷冻切片的确定置信区间(95% CI = 6476-16 372)与中度分化切片或正常组织有明显区别。对于正常组织，使用3103 ~ 7113 (95% CI)之间的MFI作为阳性检测的最佳阈值区间。令人惊讶的是，所有冷冻切片的mfi分布在相应的四个确定的阈值中，具有100%的灵敏度和特异性。综上所述，这些发现表明，MFI测定的冷冻切片的分化等级与肿瘤细胞中NADH的水平有很好的相关性，突出了NADH指标在精准医学试验中用于IOPD和肿瘤分级的潜在效用。
以上结果表明，CyQ-1可为肺癌鉴别提供有用的组织学信息，对IOPD具有较高的特异性和敏感性。此外，石蜡切片和冷冻切片对肿瘤分级的分化能力相似，这意味着利用制备的荧光探针快速评估不同肿瘤组织中NADH的表达水平，有可能成为快速准确识别IOPD和肿瘤分级的通用诊断标准，而不局限于癌症类型。
结论
综上所述，本文开发了一种新型的基于A−π-A小分子的NAD(P)H指示剂CyQ-1，该指示剂由可调菁菁染料和喹啉单元组成。开发的CyQ-1已被证实对NAD(P)H测量具有高选择性和灵敏度，具有快速响应，在500-600 nm波长范围内具有强烈的“开启”吸光度，在583 nm处具有强烈的荧光发射增强(约10倍)。优越的光学性能和较低的测试成本(成本约为NAD(P)H检测试剂盒的5%)使其成为NADH表达水平原位生物成像的理想候选者。正如预期的那样，NADH指示物CyQ-1不仅可以在纳摩尔水平检测细胞内NADH的表达水平，还可以监测NAD+依赖性酶的活性。
此外，CyQ-1也被证实具有区分正常细胞和肿瘤细胞的能力，甚至可以区分分化程度不同的肿瘤细胞。最后，CyQ-1在组织切片水平的NADH梯度原位分析中表现优异，包括120例结直肠癌石蜡包埋切片和20例术中肺癌冷冻切片。此外，无论是石蜡切片还是冰冻切片，CyQ-1对肿瘤分化水平的敏感性和特异性均在90%以上。本研究表明CyQ-1在IOPD和肿瘤切片分析中具有良好的诊断能力。值得注意的是，鉴于各种肿瘤细胞中NADH的平均水平不同，我们需要针对不同类型的肿瘤建立相应的诊断模型，以实现准确的诊断。这也是我们下一个研究目标。我们预计，本文所描述的方法可能会发展成为一种通用的、快速的方法，用于未来的IOPD应用和肿瘤级初步分类。
参考文献
NAD(P)H Activated Fluorescent Probe for Rapid Intraoperative Pathological Diagnosis and Tumor Histological Grading. Chaojie Yang,Chenxia Jiang, Majun Yang,Qingqing Bai, Yaya Zhen, Yuxue Zhang, Weiyi Yin, Jian Wang, Xiaobo Zhou, Guo Li, Mingmin Wu, Yuling Qin, Qi Wang,* Haiwei Ji,* and Li Wu. Chem. Biomed. Imaging. https://doi.org/10.1021/cbmi.3c00076
