内容提要
气体疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗策略。然而，与气体疗法相关的局限性包括缺乏靶向亚细胞细胞器准确性和时空释放精度。在这项研究中，作者基于n -亚硝化上转化发光罗丹明支架开发了一系列可光激活的一氧化氮(NO)供体NRh-R-NO (R= Me, Et, Bn, iPr和Ph)。在808 nm光照射下，只有NRh-Ph-NO能有效释放NO和NRh-Ph，在740 nm处有明显的开启频率上转换发光(FUCL)信号，这是由于N-N键解离能较低。作者还研究了气体治疗涉及的多阶段近红外控制级联释放，包括NRh-Ph-NO随一个NRh-Ph分子生成释放的NO, NRh-Ph光动力治疗(PDT)效应产生的超氧阴离子O2•-，以及NO和O2•-共存产生的高毒性过亚硝酸盐阴离子(ONOO -)。经过轻微的纳米修饰，纳米生成器(NRh-Ph-NO NPs)具有良好的生物相容性，可以靶向线粒体。在808 nm激光照射下，NRh-Ph-NO NPs可诱导NO/ROS生成RNS，导致线粒体膜电位降低，并通过caspase-3激活引发细胞凋亡，进一步诱导肿瘤免疫原性细胞死亡(ICD)。NRh-Ph-NO NPs的体内治疗结果显示增强的RNS增强气体治疗，在实时FUCL成像指导下显示出良好的生物相容性和有效的肿瘤抑制作用。总的来说，这种多用途的策略定义了靶向rna介导的癌症治疗。
结果与讨论
NRh染料和NO给体的合成、表征及上转化性能
基于所报道的罗丹明支架的FUCL性质，作者在母核上引入不同取代基(甲基、乙基、苄基、异丙基和苯基)，合成了一系列罗丹明衍生物NRh-R (R = Me、Et、Bn、iPr和Ph)。前体NRh-R是根据先前报道的方法制备的，进一步的细节请参见辅助资料。NRh-R-NO合成示意图如图所示。通常，期望的最终产物，亚硝化化合物NRh-R-NO，通过与NaNO2亚硝化得到，其结构通过1H NMR, 13C NMR和高分辨率质谱证实。
对NRh-R和NRh-R- no (R = Me, Et, Bn, iPr和Ph)的光学性质进行了表征。亚硝化后，NRh-R-NO的最大吸收峰出现从720 nm到600 nm左右的蓝移。与NRh-R前体相比，NRh-R- NO的上转换发光表现出微弱的发射。这些结果主要归因于N-亚硝化基团的吸电子特性。通过NRh-R染料在甲醇溶剂体系中的FUCL行为验证了其ful性能。随着温度从0℃升高到40℃，NRh-R吸光度逐渐降低。相比之下，808 nm激光照射后，NRh-R的FUCL强度增强。此外，随着激光功率密度的增加，740 nm处的反stokes发射呈线性关系逐渐增加，证实了激子过程是由热带吸收辅助的单光子过程引起的。
NO供体808纳米触发和控制释放特性
用808 nm激光照射不同NO供体溶液，通过吸收光谱和FUCL光谱研究NRh-R-NO (R = Me, Et, Bn, iPr和Ph)的光俘获效率。有趣的是，与其他NO供体相比，808 nm激光只能触发NRh-Ph-NO。在580 nm和620 nm处，NRhPh-NO的最大吸收逐渐降低，在720 nm处，NRh-Ph的特征吸收峰增加。随着辐照时间的延长，NRh-Ph在740 nm处的FUCL信号显著增强。相比之下，NRh-R-NO (R = Me, Et, Bn, iPr)的吸收光谱和FUCL光谱强度几乎没有变化(辅助信息图S30)。这些结果表明，在808 nm激光刺激下，只有NRh-Ph-NO能够分解成捕获NO的FUCL染料NRh-Ph。因此，进一步研究一氧化氮释放的可控性对于体内气体治疗显然是有必要的。
通过荧光响应监测NRh-Ph-NO的NO释放过程，因为NRh-Ph-NO可以通过周期性调节808 nm近红外照射灯的开灭交替激活和失活。只有808 nm光等外界刺激才能诱导NO释放，使得NO释放的时空特异性可控性成为可能。通过Griess法测定NO释放量。
此外，进行了密度泛函理论(DFT)计算，以解释为什么只有苯基取代的NO供体可以释放。结果表明，NRh-R-NO (R = Me、Et、Bn、iPr和Ph)的N-N键离解能(BDE)分别为39.4、38.9、38.9、39.4和30.4 kcal/mol。NRh-Ph-NO比其他NO供体更容易释放NO，这与之前的实验数据一致，表明NRhPh-NO是一种潜在的808 nm光活化NO供体候选供体。
808 nm触发NO释放机制及NRh-Ph-NO的RONS检测
ROS/RNS的生成途径示意图。苯基取代N -亚硝胺的光解反应是通过一个含有带正电的二价氮原子的反应中间体，同时释放NO。以RhBs为NO指示剂，2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基3氧化物(PTIO自由基)为自旋捕集剂，利用荧光和电子自旋共振(ESR)光谱研究了NRh-Ph-NO光解过程中NO的释放和生成。随着808 nm光照射时间的延长，RhB和PTIO信号的特征峰逐渐增强，表明NRh-Ph-NO具有有效的光控释放能力，诱导NO释放和生成NO。在NO释放过程中，受激发的NRh-Ph-NO体系生成NRh-Ph分子，通过808 nm激光激活O2•-的生成，实现NIR增强PDT效应。因此，作者利用二氢膦胺123 (DHR 123)监测O2•-生成，并确定NRh-Ph-NO是否能增强NIR催化。将NRhPh-NO与DHR 123探针混合后，在808 nm照射14 min时收集荧光光谱。在808 nm辐照下，DHR 123在526 nm处的特征峰显著增加，表明其有效生成O2•。此外，还进行了ESR实验来检测光解过程中O2•-的生成。在近红外光照射下，NRh-Ph-NO中的O2•-水平显著增加(图3g)，进一步证实NRh-Ph-NO可以作为潜在的光敏剂生成O2•-。
此外，在808 nm光照射下，Yoon等人根据650 nm处的荧光变化，用ONOO-特异性探针检测到NRh-Ph-NO溶液中光生成的非自由基物质ONOO -。荧光波动与NO和O2•-的生成呈正相关。利用高斯16在B3LYP/6-311G(d)理论水平进行了DFT对NRh-Ph-NO脱壳过程的光物理机制 。N - NO键对- NH(Ph)取代基产生π电子和结构效应，促进了分子内电荷转移(ICT)过程，引起吸收蓝移，与前人的结果一致。综上所述，NRh-Ph-NO系统可以通过释放808 nm激活的NO并将NO转化为NO∙、nrhph诱导的ROS生成和ONOO -生成来实现肿瘤气体治疗的三倍扩增，从而改善RNS介导的癌症治疗。
纳米生成器NRh-Ph-NO NPs的制备与表征
受NRh-Ph-NO优异的近红外光响应性能和活性氮生产能力的激励，作者通过可生物降解的dspe - mpeg5000辅助NRh-Ph-NO的包封制备了NRh-Ph-NO NPs用于体内应用。动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)分析表明，NRh-PhNO NPs呈球形，易于分散在水溶液中，水动力尺寸约为48 nm。通过监测808 nm连续激光照射下NRh-Ph-NO NPs的紫外-可见/近红外吸收和FUCL信号，研究了NPs对近红外光的响应。与808 nm辐照时一样，NRh-Ph-NO NPs在600 nm附近的吸光度逐渐降低，而在720 nm处的近红外吸收增加。
因此，NRh-Ph-NO NPs在740 nm处的FUCL信号显著增强。作者还评估了NRh-Ph-NO NPs产生RNS的能力。添加特异性ONOO -探针PNAP后，随着808 nm激光照射时间的延长，640 nm处的荧光强度逐渐增加，证实了ONOO -的产生。此外，通过CCD成像来检测可控性，滤纸上的字母“CPU”可以选择一次点亮一个字母。因此，期望纳米发生器严格遵守近红外光激活，并通过FUCL监测验证时空气体释放。结果表明，水溶液中NRh-Ph-NO NPs对近红外光的响应提供了“off-on”的FUCL信号和潜在的ONOO-生成能力。
808 nm激发NRh-Ph-NO NPs的体外细胞气体治疗
光控释放能力和光解可视化是纳米发生器有效进入肿瘤细胞以获得高治疗效果的重要条件。将4T1细胞与NRh-Ph-NO NPs和特异性NO指示剂探针Rhb孵育，验证NRh-Ph-NO NPs在癌细胞中的近红外光控制光解作用。未经激光照射的NRh-Ph-NO nps处理的细胞中，FUCL和NO指示剂探针荧光信号可以忽略不计。808 nm辐照后，NRh-Ph-NO NPs逐渐亮起并触发NO释放，NRh-Ph的红色荧光增强，NO指示剂探针Rhb的绿色荧光增强，说明近红外光活化的可控性。此外，为了证实该过程是否起源于线粒体，使用MitoTracker®探针Rh123标记4T1细胞的线粒体。在没有激光照射的情况下，NRh-Ph-NO nps处理的细胞有微弱的荧光信号。相比之下，在激光照射下观察到细胞内荧光信号，NRh-Ph FUCL信号模式与Mito Tracker Rh123重叠，证实了线粒体中NRh-Ph- NO NPs的特异性光解。接下来，使用荧光探针DHE和PNAP分别检测O2•-和ONOO -，评估NRh-Ph-NO NPs的细胞内RONS水平。808 nm辐照后NRh-Ph-NO nps处理的细胞比对照组具有更强的绿色荧光，显示出更高的RNS生成。
在验证了近红外光诱导的线粒体气体级联反应后，作者探索了线粒体损伤的协同效应。NO和ROS/RNS可改变线粒体膜电位(ΔΨm)，导致细胞凋亡。线粒体膜电位测定试剂盒JC-1检测ΔΨm变化。JC-1以聚集体形式聚集在ΔΨm较高的活细胞线粒体基质中，以单体形式分散在ΔΨm51较低的凋亡细胞胞浆中。从图可以看出，随着辐照时间的增加，NRh-Ph-NO NPs处理的4T1细胞的绿色荧光强度随着近红外通道信号的增强而逐渐增强。这些结果验证了NRh-PhNO NPs能够实时监测线粒体内NO的释放，并可能触发RNS的联合作用，并在光解后损伤关键的线粒体膜。考虑到NRh-Ph-NO NPs在808 nm激光刺激下的级联反应，采用MTT法研究纳米发生器的体外生物相容性和抗肿瘤作用。不同浓度NRh-Ph-NO - NPs孵育24h后，4T1细胞的存活率均在85%以上，表明纳米发生器具有较高的生物相容性。808 nm激发后，4T1细胞的存活率下降到27%，说明808 nm光照射下的NRh-Ph-NO NPs可以有效抑制癌细胞生长。通过钙黄素-AM (AM)/碘化丙啶(PI)共染色和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的流式细胞术，进一步研究了体外光催化气体治疗在4T1细胞中的抗癌作用。通过活/死染色，在NRh-Ph-NO NPs和808 nm光处理的细胞中观察到明显的红色荧光，表明对癌细胞有明显的细胞毒性。808 nm激光照射5 min和10 min后，NRh-Ph-NO NPs对4T1细胞的凋亡率分别为0.43%、22.1%和42.9%，表明NRh-Ph-NO NPs可以调节细胞凋亡，发挥近红外光照射的治疗作用。
随后，采用Western blotting检测4T1细胞NRh-Ph-NO NPs的细胞死亡途径和机制。与其他组相比，808 nm激光照射组NRh-Ph-NO NPs中与凋亡相关的cleaved caspase-3被RNS的产生显著上调，导致线粒体损伤和细胞死亡。AM/PI和流式细胞术对细胞凋亡进行了类似的分析。这些数据证实，808 nm光照下的NRh-Ph-NO NPs通过增加裂解的caspase-3水平导致细胞明显凋亡。
研究表明，在免疫原性细胞死亡(ICD)过程中，死亡的肿瘤细胞可能释放损伤相关的分子模式(DAMPs)，包括钙网蛋白(CRT)和高迁移率组框1 (HMGB-1)。因此，作者通过免疫荧光染色检测4T1癌细胞的CRT分泌和HMGB1释放，验证NIR触发的气体治疗除了直接杀死癌细胞外，是否导致了ICD。808 nm长时间激光照射下，NRh-Ph-NO NPs处理细胞的表面暴露CRT水平明显高于非激光照射细胞。此外，通过NRh-Ph-NO NPs加近红外照射观察到HMGB-1的有效释放。这些结果表明，NIR诱导的气体疗法可以有效地诱导4T1癌细胞ICD并释放DAMPs。NRh-Ph-NO NPs治疗后，癌细胞中高水平的CRT表达和HMGB1释放有助于激活抗肿瘤免疫，提高抗癌效果。
体内肿瘤和光控NO释放
体内生物成像对肿瘤的准确诊断和治疗起着至关重要的作用。纳米发电机的光可控性也直接决定了气体释放的位置，这反过来又影响了气体处理的有效性。具体来说，在近红外光照射下，纳米发生器可以在FUCL信号开启的情况下产生光解产物，为体内监测提供更高分辨率和灵敏度的实时FUCL读数。作者通过检测NRh-Ph的FUCL信号，研究纳米发生器NRh-Ph- NO NPs在4T1荷瘤小鼠的肿瘤部位积累和光响应特性。生物成像监测程序的详细光控释放方案。808 nm激光照射1分钟后，观察到明显的FUCL开启信号。随着照射时间的增加，NRh-Ph-NO NPs的FUCL信号在肿瘤部位变得更强，并且在激光关闭后基本保持不变。结果表明，在808 nm激光照射下，NRh-Ph-NO NPs可以在靶向肿瘤部位有效积累，实现可控的时空NO释放，这对其体内应用至关重要。
NRh-Ph-NO NPs的体内抗癌作用
808 nm激光照射下NRh-Ph-NO NPs对4T1荷瘤小鼠的体内抗癌作用。小鼠分别给予生理盐水、NRh-Ph-NO NPs、808 nm激光照射或NRh-Ph-NO NPs + 808 nm激光照射。肿瘤部位用808 nm近红外光谱(NIR)照射。注射NRh-Ph-NO NPs (5 mg/kg, 100 μL)后4 h W cm-2 10 min。每2天测量一次肿瘤生长和体重，并在14天的治疗期间进行监测。生理盐水、NRh-Ph-NO NPs或808 nm激光照射处理小鼠的肿瘤体积在治疗过程中迅速增加，几乎没有抗癌作用。相比之下，NRh-Ph-NO NPs + 808 nm激光处理小鼠表现出明显的肿瘤抑制作用，表明808 nm诱导的抗癌气体治疗作用。重要的是，在治疗期间没有观察到明显的体重变化。此外，包括静脉注射NRh-Ph-NO NPs组在内的各组小鼠主要器官的苏木精和伊红(H&E)染色均无显著差异，表明NRh-Ph-NO NPs具有良好的生物相容性和生物安全性。此外，H&E染色显示纳米发电机NRh-Ph-NO NPs对肿瘤细胞造成损伤，caspase-3免疫荧光分析显示NRh-Ph-NO NPs + NIR组肿瘤中凋亡生物标志物caspase-3水平升高。在肿瘤细胞表面大量暴露CRT蛋白也观察到类似的趋势，主要归因于RNS诱导激活的全身抗肿瘤免疫反应。TUNEL染色实验显示，与其他组相比，NRh-Ph-NO NPs + 808 nm激光处理小鼠肿瘤组织中细胞凋亡水平显著上调，表明NRh-Ph-NO NPs + NIR对实体瘤的治疗效果显著。总的来说，纳米发生器NRh-Ph-NO NPs可以协同协调气体治疗和PDT，潜在地扩大抗癌治疗效果。
结论
作者成功地开发了一系列含罗丹明的NO给体NRh-R-NO (R = Me, Et, Bn, iPr, and Ph)，并研究了它们的光物理性质。与前驱体相比，将吸电子的n-亚硝基附着在罗丹明激发的近红外染料上，导致吸收从720 nm蓝移到600 nm左右，猝灭发射为740 nm。光控释放研究和理论研究表明，在808nm光照射下，NRh-Ph-NO能在740 nm处有效释放NO并产生显著的FUCL信号，这主要是由于较低的N-N键解离能。有趣的是，在808 nm光的作用下，单一气体发生器NRh-Ph-NO产生超氧阴离子O2•-，并诱导高毒性过氧亚硝酸盐阴离子ONOO -用于RNS增强气体治疗。纳米修饰后的纳米生成器(NRh-Ph-NO - NPs)可以被精确地吸收到线粒体中，并表现出良好的生物相容性。值得注意的是，当808 nm激光触发NRh-Ph-NO NPs时，NRh-Ph-NO NPs可以激活caspase-3凋亡途径，触发肿瘤免疫原性细胞死亡，有效杀伤癌细胞。基于FUCL成像实时引导，NRh-Ph-NO NPs在体内表现出非凡的RNS增强的肿瘤根除功效。这一创新策略为RNS介导的癌症治疗的多功能平台设计带来了新的视角。
参考文献
Mitochondria-specific near-infrared photoactivation of peroxynitrite upconversion luminescent nanogenerator for precision cancer gas therapy. Hui Yu, Aliya Tiemuer, Xufeng Yao, Mingyuan Zuo, Hai-Yan Wang, Yi Liu, Xiaoyuan Chen. APSB ,2023,ISSN 2211-3835. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2023.08.019.
