内容提要
谷胱甘肽(GSH)作为一种重要的内源性抗氧化剂，在维持细胞内氧化还原稳态中起着关键作用，细胞内谷胱甘肽水平的失衡与肝损伤、癌症等多种疾病密切相关。因此，开发谷胱甘肽智能响应纳米探针，用于体内谷胱甘肽水平的原位监测，对于了解其生理和病理过程至关重要。本文利用镧系降移纳米粒子NaLuF4:Yb/Er@NaLuF4@mSiO2 (DCMS)负载Pb (BO2)2和GSH活化的H2S供体二烯丙基三硫醚(DATS)，成功设计了一种新型的GSH响应第二近红外(NIR-II, 1000-1700 nm)比例荧光探针，用于实时监测体内GSH水平。设计的纳米探针通过GSH触发级联原位硫化反应转化为NaLuF4:Yb/Er@NaLuF4@mSiO2@PbS，在808/980 nm激光激发下在1260和1525 nm处产生NIR-II正交发射。该方法对谷胱甘肽具有较高的灵敏度和特异性，检测限为67 nM。更重要的是，成功实现了急性酒精性肝损伤和GSH异常表达乳腺肿瘤中GSH的高精度特异性比值成像(F1260 nm Ex808 nm/F1525 nm Ex980 nm)。值得注意的是，比值值与谷胱甘肽水平呈线性相关。因此，设计的GSH激活的NIR-II比率探针为实时无创监测体内GSH水平提供了一种新的策略，具有高灵敏度和特异性。
结果与讨论
成功构建了GSH响应的NIR-II比例荧光探针，该探针采用镧系下移纳米粒子DCMS，负载Pb(BO2)2和GSH活化的H2S供体DATS，用于实时监测体内GSH水平。首先，典型的透射电镜(TEM)图像显示，制备的NaLuF4:Yb/Er核和NaLuF4:Yb/Er@NaLuF4核-壳保持了均匀的尺寸和良好的单分散性。尺寸分布分别约为36.6 nm和42.2 nm。与内核相比，NIR-II b (1525 nm)涂层惰性壳后的荧光强度提高了4倍。随后，为了有效加载DATS和Pb(BO2)2纳米点，在核壳结构的外表面涂覆了一层介孔二氧化硅(mSiO2)层。测得的厚度、孔径和表面积分别约为10 nm、3 nm和280.9 m2 g−1。然后，将Pb(BO2)2纳米点沉积到mSiO2壳层中，形成卫星状结构DCMS-Pb(BO2)2。x射线光电子能谱(XPS)也证明了Pb(BO2)2的成功生长。最后加载DATS，实现GSH特异性应答。在室温下，在水溶液中加入谷胱甘肽，进行活化级联硫化反应，通过原位硫化将无荧光的Pb(BO2)2纳米点转化为NIR-II a发光的PbS纳米点。GSH激活后DCMS-Pb/DATS的形态发生了显著变化，表明其具有有效的GSH应答能力。XPS分析也证明了原位合成的PbS纳米点。傅里叶变换红外光谱(FTIR)显示了DCMS-Pb/DATS探针合成过程中表面配体的变化。对于油酸修饰的NaLuF4:Yb/Er@NaLuF4纳米粒子，2925和2857 cm−1处的峰分别是OA长烷基链甲基-CH2的不对称和对称拉伸振动。包覆mSiO2后，1037 cm−1处的新峰对应于Si-O-Si的拉伸振动。然后，在DCMS-Pb(BO2)2纳米复合材料中加载DATS后，检测到明显的S-S键，特征峰位于465 cm−1处，表明DATS加载成功。通过对DCMS-Pb和DCMS-Pb/DATS的热重分析，得出DATS的加载比为13.4%。为了进一步揭示结构转变，检测了GSH活化前后的核、核-壳和DCMS-Pb/DATS的粉末x射线衍射(XRD)图谱。从图中可以看出，核纳米粒子和核壳纳米粒子均呈现纯六方相结构(JCPDS: 28-1192)。在DCMS-Pb/DATS样品中观察到Pb(BO2)2的特征峰。更重要的是，加入GSH后，检测到新的PbS特征峰(JCPDS: 05-0592)，明确地阐明了GSH引发的原位硫化反应。
作者系统评估了所设计的DCMS-Pb/DATS纳米探针的GSH响应NIR-II比率荧光特性。通过添加不同浓度的GSH(0、5、25、50、75、100 μM)来评估NIR-II的荧光响应特性。结果表明，在980 nm激光照射下，所设计的探针在1525 nm处具有高效的NIR-IIb发射。更重要的是，加入GSH后，在808 nm激光照射下观察到NIR-IIa (1260 nm)的导通荧光，并且通过提高GSH含量，使导通荧光强度显著提高，验证了GSH触发级联硫化反应形成NIR-IIa发射的PbS纳米点。此外，在808/980 nm双激光照射下，收集了GSH的比值荧光成像(F1260 nm Ex808 nm/F1525 nm Ex980 nm)，表明比值值与GSH浓度之间具有良好的线性关系。通过拟合曲线计算出GSH的检出限为67 nM。NIR-II荧光光谱也验证了DCMS-Pb/DATS探针良好的GSH响应能力，与NIR-II和比例荧光成像结果吻合良好。为了进一步揭示GSH的级联硫化活化作用，我们通过5,5′-二硫比斯(2-硝基苯甲酸)(DTNB)对H2S供体DATS的GSH消耗能力进行了评价。GSH (100 μM)含量明显下降，在6 h内几乎耗尽。同时，在808/980 nm激光照射下采集NIR-II荧光图像。与980 nm激光照射下NIR-IIb荧光强度不变相比，808 nm激光照射下NIR-IIa荧光强度与GSH降解呈正相关，进一步说明了高效的GSH响应能力。需要注意的是，生物系统中的pH值和电解质离子可能会影响GSH响应的准确性。因此，我们评估了DCMS-Pb/DATS探针在不同pH值(pH = 5.5, 6.5, 7.4)下对GSH的NIR-IIa荧光响应。结果表明，pH值对GSH的活化过程影响不大。另一方面，选择常见的生物分子和电解质(Na+， OH-， Cu2+， SO42-， Ca2+， F-， HCO3-， NH4+， GSH)来验证GSH的特异性响应。除了GSH具有优异的快速响应能力外，其他生物分子和电解质均未检测到活化的NIR-IIa荧光，证明DCMS-Pb/DATS对GSH水平监测具有较高的抗干扰特异性。
上述GSH模拟激活实验为体内GSH含量的动态实时监测奠定了基础。为了进一步实时检测体内谷胱甘肽含量，我们对DCMS-Pb/DATS纳米探针的生物毒性和溶血试验进行了评价。通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)试验证实了可忽略的细胞毒性。同时，也证实了良好的血液相容性。重要的是，通过苏木精-伊红(H&E)染色分析进一步进行了体内长期毒性评估。注射DCMS-Pb/DATS纳米探针15天和30天后，未发现明显的器官损伤。然后，系统评估DCMS-Pb/DATS的体内GSH响应特性。首先，正常昆明小鼠皮下注射DCMS-Pb(BO2)2(位点1、2)和DCMS-Pb/DATS(位点3、4)，然后皮下注射谷胱甘肽溶液(位点2、4)。
NIR-II荧光和比例图像显示，仅在位点4(同时存在DATS和GSH)检测到强烈的NIR-IIa (Ex = 808 nm, filter: 1000-1400 nm)信号，证实了GSH响应的可行性。为了揭示GSH在体内检测的高灵敏度，我们将所设计的DCMS-Pb/DATS探针皮下注射于正常小鼠的6个腹部部位，然后加入20 μL不同含量的GSH水溶液(1:0 μM、2:50 μM、3:100 μM、4:500 μM、5:1 mM、6:5 mM)。在808/980 nm激光照射下，分别于0、10和30 min采集NIR-IIa/NIR-IIb荧光图像和强度值。随着GSH含量的增加，NIR-IIa荧光信号的开启显著增加，在低GSH水平(50 μM)下也观察到NIR-IIa荧光信号的高效，表明体内对GSH的检测非常敏感。
受外源性GSH出色的体内应答性能的鼓舞，我们进一步通过构建过表达GSH水平的4T1肿瘤模型来评估DCMS-Pb/DATS探针检测内源性GSH的能力。然后，将DCMS-Pb/DATS纳米探针皮下注射到荷瘤小鼠的正常组织和4T1肿瘤部位，在0、0.5、2和6 h采集NIR-IIa/NIR-IIb荧光图像。正常组织和肿瘤部位均在荧光强度不变的980 nm激光照射下呈现NIR-IIb荧光信号。808 nm激光照射正常组织部位未见NIR-IIa荧光信号。与正常组织部位相比，808 nm激光照射肿瘤部位可检测到NIR-IIa信号的开启，且随着注射时间从30 min延长至6 h, NIR-IIa信号显著增加。更重要的是，只有肿瘤部位出现了比值荧光信号( F1260 nm Ex808 nm/F1525 nm Ex980 nm)，且在6 h内比值信号从0.03逐渐增加到1.4。表明NIR-II比值成像方法对过表达GSH的肿瘤具有敏感性和特异性。这是由于肿瘤区域过表达GSH激活了DCMS-Pb/DATS纳米探针。这些发现为在NIR-II成像窗口中原位监测恶性肿瘤氧化还原稳态提供了一种新的比值成像策略。
肝脏是最重要的代谢性解毒器官，GSH介导的肝内生物转化是一个众所周知的解毒过程。正常肝脏局部GSH含量高达~10 mM，而长期饮酒会使肝脏负荷过大，导致肝损伤，相应的GSH浓度会远低于正常水平。因此，我们构建急性酒精性肝损伤模型，进一步验证DCMS-Pb/DATS纳米探针实时NIR-II比例荧光检测肝脏GSH水平。采用酒精直接灌胃昆明小鼠3、7 d，建立不同损伤程度的酒精性肝损伤模型。与正常组相比，小鼠肝脏区域GSH含量显著降低，分别为53%(连续3天酒精喂养，简称A-3D)和31%(连续7天酒精喂养，简称A-7D)。通过腹腔注射一种GSH抑制剂马来酸二甲酯(dimethyl maleate, DEM)，阳性对照组也表现出同样的趋势。谷草转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)指标也证实了持续口服酒精引起的肝损害。
随后，将正常/模型小鼠分为5组(1组:DCMS-Pb(BO2)2，正常小鼠+ PBS;第二组:DCMS-Pb/DATS，正常小鼠+ PBS;第三组:DCMS-Pb/DATS，正常小鼠+ DEM;第4组:DCMS-Pb/DATS，模型小鼠+ 3d;第5组:DCMS-Pb/DATS，模型小鼠+ 7d)原位NIR-II比例荧光法监测体内GSH水平。如第1组所示，在没有DATS (H2S供体)的情况下，即使肝脏GSH浓度很高，Pb(BO2)2也不能被激活。相比之下，在DCMS-Pb/DATS探针中加入DATS后，第2组可以检测到明显的NIR-IIa/NIR-IIb荧光信号。为了进一步揭示GSH水平对成像信号的影响，我们构建DEM诱导的GSH抑制模型。与2组相比，可以清楚地看到，DEM诱导的GSH抑制小鼠(3组)直到静脉注射DCMS-Pb/DATS探针30 min后才出现明显的NIR-IIa荧光信号，反应较弱且延迟，这是由于GSH水平的降低大大削弱了NIR-IIa荧光的级联激活作用。在此基础上，对急性酒精性肝模型进行肝损伤的活体实时监测。当老鼠在4组口服服用酒精对3 d,激活NIR-IIa和比率荧光信号被发现显著延迟组2相比,表现出类似的趋势的民主党治疗小鼠(组3),这一趋势越来越明显的口服吸收较长的酒精(5组)。此外,与正常小鼠(组2)相比,比率荧光强度表现出明显的衰减趋势组4和5。上述结果表明，所设计的DCMS-Pb/DATS探针能够准确监测肝脏中GSH含量的变化，为GSH相关疾病的实时成像和体内GSH水平的监测提供了一种新的高灵敏度和特异性的NIR-II比率荧光策略。
结论
综上所述，我们通过将镧系NaLuF4:Yb/Er@NaLuF4@mSiO2纳米粒子与Pb(BO2)2和GSH活化的H2S供体DATS结合，探索了一种新型可活化DCMS-Pb/DATS纳米探针，用于体内GSH的实时监测。所设计的纳米探针对GSH具有高灵敏度的抗干扰特异性检测，检测限为67 nM，这主要是由于GSH触发级联原位硫化反应形成NIR-IIa发射的PbS纳米点，在808/980 nM激光激发下在1260和1525 nM处产生NIR-II正交发射。更重要的是，在不同损伤程度的急性酒精性肝损伤和乳腺肿瘤中均成功实现了GSH的高度精确和特异性的比值成像，且比值与体内GSH水平高度相关。因此，这种方法为无创动态评估GSH水平和体内GSH相关疾病的可视化提供了新的机会。
参考文献
Activatable NIR-II ratiometric fluorescence nanoprobe for in vivo real-time dynamic imaging of GSH and its-associated diseases. Shenghui Bi, Xingwang Wen, Ge Sun, Songjun Zeng. Nano Today 53 (2023) 102027. https://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102027
