内容提要
半胱氨酸组织蛋白酶诱导纤维帽分解，导致动脉粥样硬化斑块破裂，是心脏病发作、中风等急性心血管事件的重要诱因。然而，由于现有的动脉粥样硬化相关组织蛋白酶荧光探针特异性低且穿透深度不足，因此准确测量斑块中组织蛋白酶B (CTB)活性具有挑战性，阻碍了对斑块易损性的可靠评估。为了解决这些限制，作者将亲脂烷基链和亲水CTB底物添加到半花青碱支架中，开发出一种脂解锁CTB响应探针(L-CRP)，该探针使用脂质和CTB作为解锁光声(PA)信号的两个关键，用于测量亲脂环境中CTB活性。这些特性使L-CRP能够可靠地成像泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块中特定的CTB活性，同时对脂质缺乏环境(如m1型巨噬细胞和LPS诱导的炎症病变)中的CTB保持沉默。此外，与目前基于近红外荧光成像的CTB探针(~ 0.3 cm)相比，L-CRP可激活的PA信号具有更深的组织穿透能力(>1.0 cm)，适用于活体小鼠动脉粥样硬化成像。在动脉粥样硬化小鼠中，L-CRP动态报告斑块内CTB水平，其与斑块易损特征(如纤维帽厚度、巨噬细胞募集、坏死核心大小)密切相关，从而实现动脉粥样硬化小鼠合并肺炎的风险分层。此外，L-CRP成功地识别了切除的人动脉组织中的动脉粥样硬化斑块，有望在临床应用中辅助诊断斑块易损。
结果与讨论
L-CRP的设计、合成和反应
为了创建一个脂质解锁CTB响应探针(L-CRP)， IR780 -烷基与间硝基酚和氯化亚锡(SnCl2)结合，形成具有亲脂性烷基链的HD -烷基。接下来，使用亲水性cvb可切割肽底物(Val-Cit)生产L-CRP，其中包含半花青碱支架，亲脂烷基链和亲水二肽。这些化合物的成功合成通过核磁共振(NMR)光谱或质谱(MS)进行了表征(见辅助资料)。在L-CRP非活化状态下，由于亲脂烷基链和亲水二肽的存在，L-CRP可以在亲水环境中自组装成纳米颗粒。同时，LCRP的氨基被CTB可切割肽底物笼住，抑制分子内电荷转移(ICT)效应，在亲水环境下产生难以察觉的PA信号。当CTB存在时，它识别L-CRP的二肽形成HD -烷基，具有很强的分子内电荷转移作用。但由于亲脂烷基链的存在，HD -烷基在亲水环境中溶解度较差，仍以聚集体形式存在，仅表现出轻微的PA信号。在脂类存在的情况下，HD-烷基可以很好地分散并转化为单体，在亲脂环境中产生强烈的PA信号。因此，通过引入亲脂烷基链，L-CRP在CTB和脂质共存时表现出可激活的PA信号。
在获得L-CRP后，作者测试了它在亲水和亲脂环境下对CTB的反应性。为了模拟亲水性环境，作者使用CTB工作缓冲液(含100 mM PB、55 mM NaCl、1 mM EDTA和5 mM GSH; pH = 5.0)，而CTB工作缓冲液含有乙太醇和脂质体来模拟亲脂环境。作者将L-CRP与CTB孵育，分别测定了L-CRP在亲水和亲脂环境下的吸收光谱和PA信号。加入CTB后，在~ 720 nm处观察到一个新的峰，表明CTB在亲水环境中识别L-CRP。然后作者研究了L-CRP在亲水环境或亲脂环境下对CTB的特异性。在没有CTB的情况下，LCRP在亲水和亲脂环境中都表现出弱的PA信号。与CTB孵育后，L-CRP的PA信号在亲脂环境而非亲水环境中显著增加，表明L-CRP仅在CTB和亲脂环境中均表现出可激活的PA信号。由于含有疏水空腔的蛋白可能干扰L-CRP的PA信号，作者进一步测试了牛血清白蛋白(BSA)对L-CRP的PA信号的干扰。在BSA存在的情况下，L-CRP仍然表现出只有在CTB和亲脂环境同时存在时才会触发的PA信号的显著增强，这表明BSA对LCRP的脂质解锁CTB反应的影响可以忽略不计。
为了探索脂质解锁CTB响应特性，作者对HD -烷基(L-CRP响应CTB的最终产物)在不同溶剂中的吸收光谱和PA信号进行了综合分析。由于HD -烷基在H2O中的溶解度较差，因此HD -烷基在H2O中的最大吸收较低，PA信号较弱。当HD -烷基分散在有机溶剂中(如EtOH、MeOH和DMSO)时，其最大吸收峰和PA信号显著增加。这些结果表明，HD -烷基在有机溶剂中的PA强度远远高于在H2O中的PA强度。
接下来，作者研究了脂质体和EtOH对HD -烷基的PA信号强度的影响，随着脂质体浓度(0 ~ 850 μg/mL)和EtOH百分比(0 ~ 100%)的增加，PA信号强度显著增加。此外，作者还研究了牛血清白蛋白对HD -烷基聚酰胺强度的影响。随着BSA浓度的增加(0 ~ 5 mg/mL)， HD -烷基的PA信号变化不大。这些结果表明，亲脂环境下HD -烷基的PA信号远高于亲水环境，而受BSA的影响较小。此外，HD -烷基的吸光度、荧光和PA信号在不同的pH缓冲液中有轻微的变化。
此外，作者计算了HD -烷基在亲水和亲脂环境下的光热转化效率(η)，因为光热转化效率与化合物的PA性能呈正相关。具体地说，将溶解于水溶液、脂质体水溶液和乙醇水溶液中的HD -烷基用660 nm激光照射240 s。然后用热像仪记录HD -烷基的加热(0 ~ 240 s)和冷却(240 ~ 480 s)曲线。HD -烷基在脂质体水溶液(65.1℃)和乙醇水溶液(72.4℃)中的最高温度明显高于在水溶液(55.0℃)中的最高温度。计算得到的HD -烷基在脂质体水溶液(35.2%)和乙醇水溶液(34.6%)中的光热转化效率均高于在H2O中的光热转化效率(21.3%)。这些结果表明HD烷基在亲脂环境中表现出较强的光热转化能力。作者研究了L-CRP在不同环境下的水化粒径。作者的动态光散射(DLS)结果显示，无论CTB是否存在，L-CRP在亲脂环境中直径较小(约1 nm)，而在亲水环境中其尺寸显着增加(约300 nm)。因此，L-CRP的大小是由环境决定的，与CTB无关。
总的来说，作者的研究结果表明，L-CRP仅在CTB和脂质同时存在时才能表现出可激活的PA信号，而在亲水环境中对CTB保持微弱的PA信号。这些特性使得L-CRP能够在亲脂环境中以高特异性可靠地检测CTB活性。接下来，作者通过结合CTB可切割二肽和HD合成了一个对照探针(CTB响应探针，CRP)。CRP可被CTB激活，但不具有亲脂烷基链。在非活化状态下，由于其良好的溶解度，CRP以单体形式存在于亲水环境中，抑制分子内电荷转移效应，表现出较弱的PA信号。当暴露于CTB时，CRP的二肽被CTB裂解形成HD，具有较强的分子内电荷转移效应和较强的PA信号。作者研究了CRP对CTB的反应，发现CRP对CTB表现出良好的反应性。此外，作者测试了CRP在亲水和亲脂环境下的PA反应，在亲水和亲脂环境下，CRP的PA信号在与CTB孵卵后都得到增强。作者还研究了牛血清白蛋白对CRP反应的干扰。在BSA存在的情况下，作者发现CRP + CTB的PA信号高于不存在BSA的情况，说明BSA可以干扰CRP的PA信号。
最后，作者测量了CRP在不同环境下的水化粒径，无论是否存在CTB，在亲水和亲脂环境下，CRP的水化粒径都很小(约1 nm)。
这些结果表明，CRP在亲水和亲脂环境中都可以表现出可激活的信号，而在炎症环境(CTB和脂质缺乏)中可能是非特异性激活的，从而导致潜在的假阳性结果。相比之下，L-CRP的PA信号仅在亲脂环境下被CTB增强，而BSA对L-CRP + CTB的PA信号的干扰可以忽略不计，这表明L-CRP比CRP更适合于可靠地检测动脉粥样硬化斑块中CTB的活性。
亲脂环境下L-CRP对CTB的反应
接下来，作者系统地研究了脂质解锁CTB响应探针(L-CRP)在不同环境下对CTB的响应性。将L-CRP与不同活性的CTB在亲水环境(CTB工作缓冲液)中孵育2 h，然后加入H2O或EtOH模拟亲水或亲脂环境。在亲水环境下，与CTB孵育后L-CRP的荧光和PA信号变化可以忽略不计。相比之下，在亲脂环境下，结果表明，在CTB活性从0增加到75 U/L的情况下，L- crp被CTB识别并转化为HD -烷基，L- crp的特征吸收峰在~ 600 nm处下降，HD -烷基的吸收峰在695 nm处增强。反应动力学研究表明，CTB作用后，L CRP在695 nm处的吸光度逐渐增加，并在120 min时达到平稳。
L-CRP对CTB的荧光反应也被观察到，与CTB孵育后，在720 nm处荧光发射明显增强。在亲脂环境下，L- CRP在720 nm处的荧光强度与CTB活性在0 ~ 75 U/L范围内呈线性正相关，说明在这种环境下，L- CRP的荧光信号可以用来反映CTB水平。L-CRP的PA信号也随着CTB活性从0到75 U/L的增加而逐渐增强，在亲脂环境下，L-CRP的PA695 (695 nm处PA强度)与CTB酶活性呈线性正相关(R2 = 0.986)，计算检出限(LOD)为0.683 U / L。L-CRP在亲脂环境中对CTB也表现出极好的选择性，因为L-CRP的PA695在各种干扰物的存在下变化可以忽略不计，包括金属离子(如Zn2+、Cu2+、Fe2+和Mn2+)、活性氧化物质(如H2O2和HClO)和其他酶(如MMP2和CTB)。
作者进一步研究了使用L-CRP时PA成像和荧光成像的组织穿透能力。L-CRP与CTB孵育120分钟，分别溶解在亲水或亲脂环境中。然后，在这些溶液上覆盖不同厚度的鸡胸组织(0 ~ 1.0 cm)，分别使用活体成像系统(IVIS)和多光谱光声断层成像系统(MSOT)收集荧光和PA图像。通过鸡胸组织，在亲脂环境下，L-CRP + CTB可观察到明显的PA信号。即使组织厚度达到1.0 cm，仍然可以检测到强烈的PA信号。相比之下，当组织厚度为0.5 cm时，荧光信号在亲脂环境中可以忽略不计。计算组织厚度为1.0 cm时PA信号和荧光信号的信本比。正如预期的那样，亲脂环境下PA信号的信本比(4.0)远高于荧光信号(1.4)，这表明L-CRP + CTB的PA信号比亲脂环境下的荧光信号(~ 0.3 cm)具有更深的组织穿透深度(>1.0 cm)。
细胞和小鼠CTB特异性PA成像
作者进一步研究了L-CRP在各种细胞(如RAW 264.7巨噬细胞、m1型巨噬细胞和泡沫细胞)中检测细胞内CTB的特异性。根据报道的方法，LPS将RAW巨噬细胞诱导为表达CTB但缺乏脂质的m1型巨噬细胞，Ox-LDL将RAW巨噬细胞转化为同时上调CTB和脂质的泡沫细胞。接下来，将RAW 264.7巨噬细胞、m1型巨噬细胞和泡沫细胞与CRP或L-CRP (5 μM)孵育2小时，并对细胞悬液进行PA成像。对于CRP探针，与RAW 264.7巨噬细胞相比，在缺乏脂质的m1型巨噬细胞和富含脂质的泡沫细胞中都观察到PA信号显著增加，表明CRP的非特异性反应。至于L-CRP探针，在RAW 264.7和m1型巨噬细胞中，由于CTB活性低或脂质含量不足，未观察到明显的PA信号。重要的是，用L-CRP培养的泡沫细胞显示出强烈的PA信号，表明L-CRP对泡沫细胞而不是脂质缺乏的m1型巨噬细胞的CTB有良好的反应。这些发现表明，L-CRP比CRP具有更高的特异性，可以精确检测泡沫细胞中的CTB活性。
由于L-CRP在亲脂环境下对CTB表现出良好的荧光响应性，因此采用荧光成像技术研究了L-CRP在泡沫细胞中的反应。CA-074-Me作为细胞内CTB的抑制剂。从IVIS成像系统采集的泡沫细胞荧光图像来看，CA-074-Me可以抑制Ox-LDL诱导泡沫细胞的荧光信号。然后用LCRP对不同进展状态的泡沫细胞进行成像。将RAW 264.7巨噬细胞与不同浓度的Ox-LDL (0 ~ 20 μg/mL)孵育或Ox-LDL (20 μg/mL)处理不同时间，以获得不同进展的泡沫细胞。然后用L-CRP处理这些细胞，并通过IVIS收集荧光图像。随着Ox-LDL浓度从0 ~ 20 μg/mL的增加，细胞荧光信号逐渐增强;同时，随着Ox-LDL孵卵时间的延长，泡沫细胞中L-CRP的荧光信号也相应增加。这些结果表明，L-CRP可以通过荧光成像成像泡沫细胞中的CTB活性。
考虑到炎性病变中CTB水平升高，作者在体内研究了L-CRP和CRP在炎性病变中的反应。在BALB/c小鼠背部皮下注射生理盐水或LPS，分别模拟正常组织和炎性病变。正常组织CTB活性低，脂质水平不足，而脂多糖诱导的炎症区上调CTB活性，但缺乏脂质。然后分别用生理盐水和LPS治疗正常组织和炎症病灶皮下注射CRP或L-CRP。在L-CPR中，LPS诱导的炎症病变与正常组织之间PA信号无显著差异，说明在脂质缺乏的炎症病变中，CTB不能激活L-CRP的PA信号。相比之下，炎性病变中CRP的PA信号较正常组织(生理盐水)明显增强(1.68倍)(P < 0.05)，提示lps诱导的炎性病变中CTB水平升高可引起CRP的非特异性活化。这些结果证实，当用于成像斑块内CTB时，L-CRP能够减少炎症病变中潜在的假阳性信号。
PA信号与斑块易损性关系的评价
L-CRP在亲脂环境中对CTB表现出良好的特异性和可激活的PA信号。假设L-CRP可能被斑块内CTB识别，形成HD -烷基，当斑块中存在脂质时，HD -烷基可以解锁HD -烷基的PA信号，从而产生与CTB活性相关的可激活PA信号。斑块内CTB水平直接反映斑块易损性，因为它是重塑斑块细胞外基质和分解斑块纤维帽的直接因素。因此，斑块内CTB水平、斑块易感性和L-CRP激活之间可能存在正相关关系。为了验证这一关系，作者将载脂蛋白E敲除(ApoE−/−)小鼠喂食高脂饮食(HFD) 20周以诱导AS小鼠，并在静脉注射L-CRP后3 h收集AS小鼠的主动脉。
获取主动脉的荧光和PA图像。AS小鼠分离主动脉不同节段荧光信号不同，这与斑块进展阶段不同有关。分析各段的荧光强度，根据荧光信号强度由低到高将主动脉分为A ~ D四段。通过测量主动脉段的PA图像，发现PA信号强度(PA695)从a段到D段逐渐增加，与荧光信号强度的变化趋势一致。为了研究不同主动脉段斑块特征，对主动脉进行冷冻切片，得到不同主动脉段的冷冻切片。采用油红O、苏木精-伊红(H&E)和免疫荧光染色对主动脉切片进行染色。油红O染色图像显示B段至D段较A段斑块明显，提示B段至D段为动脉粥样硬化病变，A段为健康动脉。
H&E染色图像分析各主动脉段平均斑块大小和平均纤维帽厚度，分别与脂质含量和CTB水平密切相关。从B段到D段，平均斑块面积明显增加，平均纤维帽厚度逐渐减少，表明从B段到D段斑块易损性增加。通过抗CTB抗体免疫荧光染色检测主动脉段(B ~ D) CTB水平，发现B ~ D段抗CTB阳性区域增加，证实B ~ D段CTB水平升高。通过抗F4 /80抗体免疫荧光染色研究这些段巨噬细胞的募集情况，这也是斑块易损的重要因素之一。从B段到D段可见到anti-F4/80荧光信号增强，表明从B段到D段巨噬细胞募集增加。通过热图系统分析这些节段中L-CRP信号与斑块易损性特征之间的关系。主动脉段L-CRP的PA强度与抗CTB、抗F4 /80抗体荧光强度、平均斑块大小呈正相关，与纤维帽厚度呈负相关。这些结果表明，L-CRP的PA信号与斑块易损性呈正相关。作者还研究了斑块中L-CRP的信号分布，共聚焦图像显示L-CRP的激活位置是斑块内CTB特异性的。
最后，系统评估不同AS小鼠纤维帽厚度(斑块易损的关键因素之一)与LCRP PA信号的关系。注射L-CRP后获得AS小鼠主动脉。然后收集主动脉695 nm处的PA图像及相应的H&E染色图像。所有主动脉H&E染色显示明显斑块。分析各切片L-CRP的PA强度和纤维帽厚度。这些主动脉段的PA信号随纤维帽厚度的增加呈负增加，说明LCRP的PA信号与斑块易感性有良好的关系。这些结果表明，L- CRP是检测斑块内CTB活性和反映斑块易感性的有力工具。
活体小鼠斑块的识别和风险分层
作者进一步促进L-CRP成像活AS小鼠斑块中的CTB活性。为了消除未激活的L-CRP背景信号对斑块中检测信号的干扰，合成了另一种对照探针(脂质和CTB无应答探针，L-CUP)。由于存在叔丁基羰基(Boc)基团，LCUP不能被CTB识别，但其背景信号与L-CRP相似。然后，对AS小鼠静脉注射L-CUP (n = 3)或L-CRP (n = 3)，并在注射后各时间点采集PA695图像。L-CRP组主动脉区PA信号在120min内明显增强(P < 0.05)。然而，L-CUP组PA695无明显变化。这些结果表明，未激活的L-CRP背景信号不显著，主动脉区域PA信号升高是由于L-CRP对斑块内CTB的激活。
此外，L-CRP用于健康小鼠和AS小鼠的成像。正常饮食20周的C57bl/6小鼠为健康小鼠(n = 3)，高脂饮食20周的ApoE−/−小鼠为as小鼠(n = 3)。注射L-CRP后，收集小鼠695 nm的PA图像，分析主动脉区域PA强度。对于注射L-CRP的健康小鼠，随着时间的推移，主动脉区域没有明显变化。相比之下，注射L-CRP后60 - 120分钟，PA695信号明显增强，表明动脉粥样硬化斑块中CTB活性升高。
此外，还评估了用L-CRP对AS小鼠合并肺炎(简称AS小鼠+肺炎)进行风险分层的可行性。急性肺炎可显著影响心血管疾病和斑块易感性。它会引发炎症，导致细胞因子释放、氧化应激，并增加斑块破裂、心脏病发作和中风的风险。因此，在急性肺炎期间密切监测和管理心血管危险因素至关重要。具体来说，ApoE−/−小鼠在高脂肪饮食中喂养14周以获得AS小鼠。为了获得AS小鼠合并肺炎模型，AS小鼠每周2次鼻内注射50 μg LPS (n = 3)。然后，对AS小鼠和合并肺炎的AS小鼠静脉注射L-CRP，并在静脉注射探针后一段时间内收集PA695图像。对于AS小鼠+肺炎组，注射L-CRP后30 ~ 120 min，归一化PA信号明显升高。对于As小鼠组，仅在注射L-CRP后120 min有显著增强。通过比较各组PA信号，120 min时AS小鼠+肺炎的PA强度比AS小鼠高1.37倍。这些结果表明，急性肺炎感染后斑块内CTB活性显著增加。
为了比较PA和荧光成像在AS小鼠体内的成像能力，分析信号变化和受试者工作特征(ROC)曲线。在荧光成像方面，注射L-CRP后，采用IVIS成像系统获得AS小鼠和AS小鼠+肺炎的荧光图像。然而，AS小鼠和AS +肺炎小鼠的荧光信号变化均不明显。对于AS小鼠组，ROC分析显示，PA强度与荧光强度的曲线下面积(AUC)为0.889，表明AS小鼠PA成像的准确性优于荧光成像。对于AS小鼠+肺炎组，PA成像的ROC分析显示比荧光成像准确率更高(AUC = 1.000)。这些数据表明，在AS小鼠+肺炎的风险分层中，LCRP的PA成像优于荧光成像。并对小鼠主要脏器进行H&E染色。AS合并肺炎小鼠肺部可见明显的炎症细胞浸润，心、肝、脾、肾等脏器未见明显损伤。此外，作者研究了L-CRP的生物分布，发现肝脏的荧光信号高于其他器官。
人体组织动脉粥样硬化斑块的影像学研究。
CTB在人类动脉粥样硬化斑块中高度表达，尤其是巨噬细胞浸润的易损斑块。可靠的CTB活性成像可以反映复杂斑块中巨噬细胞的蛋白水解酶活性。为了评估L-CRP成像人类动脉粥样硬化斑块中CTB活性的能力，从下肢动脉新鲜采集的人体组织被分为正常血管和动脉粥样硬化斑块区域。然后，将标本与L-CRP在亲水环境(CTB工作缓冲液)中孵育，并进行荧光和PA成像。从荧光和PA图像来看，与正常血管相比，L-CRP孵育后动脉粥样硬化斑块区域的荧光和PA信号明显增强。此外，斑块区域的PA和荧光信号分别比正常血管增加了3.27倍和4.20倍，表明L-CRP可能对人体组织斑块内CTB表现出可激活的信号。此外，H&E染色图像显示，在动脉粥样硬化斑块区域有明显的动脉粥样硬化病变。因此，本研究表明可活化的L-CRP在获得人体组织中蛋白水解酶活性方面具有广阔的前景。
结论
在本研究中，作者采用分子设计策略开发了一种脂质解锁CTB响应探针(L-CRP)，该探针可以无创地准确成像含脂斑块内的CTB，以评估斑块易损特征。L- CRP是通过在半花青素分子骨架中引入亲脂烷基链和亲水CTB响应二肽而构建的。由于亲脂烷基链的存在，L-CRP可以在亲水环境中自组装成纳米颗粒;同时，L-CRP的氨基被CTB可切割肽底物笼住，产生难以察觉的PA信号。随后，CTB识别L-CRP的二肽形成HD -烷基。然而，HD -烷基在亲水性环境中溶解度较差，因此仅表现出微弱的PA信号。在亲脂环境中，HD -烷基分散良好，产生强烈的PA信号。因此，这种量身定制的分子设计策略确保了L-CRP的PA信号仅在亲脂环境中被CTB激活。通过比较L-CRP与以往CTB探针的特异性，发现L-CRP仅在亲脂环境(如亲脂溶液、脂质泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块)中对CTB表现出可激活的PA信号，而在亲水环境(如亲水溶液、脂质缺乏的m1型巨噬细胞和脂质诱导的炎症病变)中表现出“弱”PA信号，提示L-CRP在亲脂环境中检测CTB具有较高的特异性。此外，与荧光成像相比，PA成像的L-CRP具有优势，尤其是在穿透深度上。在体外实验中，L-CRP + CTB在亲脂环境下的PA信号比荧光信号(约0.3 cm)的组织穿透深度更深(>1.0 cm)。体内实验也证明，PA成像在AS小鼠合并肺炎的危险分层中比荧光成像具有更高的准确性(AUC = 1.000, P = 0.0001)，这对体内动脉粥样硬化成像至关重要。因此，L-CRP的高特异性和深层组织穿透能力使其适合于体内动脉粥样硬化斑块中CTB活性的特异性成像。作者通过体外和体内实验进一步证明了L-CRP通过PA成像反映斑块易损特征的可靠性。斑块的组织学分析证实了L-CRP的PA信号与斑块易损性特征(如巨噬细胞募集和坏死核心大小)，特别是纤维帽厚度之间的良好关系。体内实验表明，L-CRP可以明显区分AS小鼠与健康小鼠，且L-CRP的PA信号在AS小鼠与合并肺炎小鼠之间表现出显著差异，提示其在高危AS小鼠的风险分层中具有潜力。此外，在分离的人类标本中发现，与正常血管相比，动脉粥样硬化斑块区域LCRP的PA信号明显增强，这为鉴定酶活性提供了有希望的临床转化前景。
参考文献
Rational Design of a Double-Locked Photoacoustic Probe for Precise In Vivo Imaging of Cathepsin B in Atherosclerotic Plaques. Yuan Ma, Jinhui Shang, Liuhui Liu, Menghuan Li, Xinyu Xu, Hui Cao, Li Xu, Wei Sun, Guosheng Song, and Xiao-Bing Zhang, J. Am. Chem. Soc. 2023,https://doi.org/10.1021/jacs.3c04981
