内容提要
由于血脑屏障和血脑瘤屏障的存在，以及缺乏高效的脑肿瘤治疗范式，脑肿瘤是最致命的癌症之一。在此，作者开发了一种在第二近红外(NIR-II)窗口具有强吸收的环氧化酶(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(mpa))修饰的生物相容性和光稳定性共轭聚合物纳米颗粒，用于头皮和颅骨脑肿瘤的精确光声成像和时空光热治疗。与普通808 nm激光相比，1064 nm激光穿透头皮和颅骨的效率更高，证明NIR-II脑肿瘤光热治疗是高效的。此外，通过实时光声成像系统，纳米颗粒通过头皮和头骨，以90这样超高信背比，帮助在近3毫米的深度清晰地定位胶质瘤。经时空光热处理后，可有效抑制肿瘤进展，明显延长小鼠生存期。这项研究表明，NIR-II共轭聚合物纳米颗粒有望用于脑肿瘤的精确成像和治疗。
结果与讨论
胶质母细胞瘤(GBM)的治疗极具挑战性，通常导致诊断患者的中位生存期不到2年。目前GBM治疗的障碍包括:(i)其浸润性强，侵袭性强，使得常规治疗模式(手术+辅助化疗或放疗)无法获得满意的缓解;(ii)难以克服血脑屏障和血脑肿瘤屏障，制约了诊断和治疗药物的肿瘤穿透;(iii)最重要的是，缺乏有效的抑制肿瘤的治疗范式。
为构建高效的脑肿瘤治疗范式，迄今为止，主要致力于开发先进的治疗体系，如化疗和基因治疗。这些方法很大程度上依赖于复杂的药物传递系统(DDS)设计，将药物/基因运输到肿瘤中，并在可控的方式下实现释放。然而，DDS在正常组织中的积累往往会导致不必要的副作用。此外，GBM细胞可迅速产生耐药性，这导致现有治疗方法的局限性。近年来，光动力治疗(PDT)、光热治疗(PTT)等光疗在精确、时空破坏肿瘤组织方面表现出优势，对正常组织无明显损害，耐药性可忽略不计。然而，依赖氧的PDT对低氧性肿瘤几乎没有治疗效果，而目前普遍使用的波长在700 nm以下的可见激光穿透力较低，几乎不可能通过颅骨和头皮进行无创性脑肿瘤治疗。相反，不依赖氧的PTT通过深穿透的近红外(NIR)激光激发，可以有效地消融缺氧肿瘤。最近报道了一些脑肿瘤PTT病例，其中一般使用808 nm激光，功率密度高(1.5 W cm−2以上)，远远超出安全极限(0.33 W cm−2)。这是因为密集的颅骨和头皮会严重衰减光，只有高功率密度激光才能让超过治疗阈值的光能到达肿瘤组织。为了缓解PTT中的光衰减问题，将808 nm激光改为1064 nm激光应该是脑肿瘤治疗的一个很好的选择，因为在1064 nm附近活组织更透明，1064 nm (1 W cm−2)的功率安全极限比808 nm激光高3倍。然而，由于缺乏第二近红外(NIR-II)光热治疗剂定制用于脑肿瘤的治疗，高效的深部脑肿瘤PTT治疗尚未实现。
到目前为止，大多数NIR-II PTT剂都是硫化铜、等离子金属簇和碳纳米管等无机材料，存在长期安全问题。小分子和共轭聚合物(CPs)等有机材料具有良好的生物相容性与小分子相比，供体-受体(D-A)结构的CPs具有良好的光稳定性和大的消光系数的优势，在PTT中具有很大的潜力。尽管很少有可溶性NIR-II光热治疗CPs用于皮下肿瘤的治疗，脑肿瘤的实验更具挑战性，因为在治疗过程中小鼠的生命受到更大的威胁。重要的是，PTT纳米颗粒(NPs)是光声成像(PA)的固有造影剂，这是一种新兴的临床转化方式，具有高分辨率到微米，深度穿透到厘米，具有相当好的灵敏度。双重治疗和成像性质有助于“一体化”治疗，具有良好的可重复性和大规模生产能力，这有利于扩大规模和从实验室到临床的转化。为了明确区分被神经包围的脑肿瘤组织和与机体代谢特征密切相关的正常组织，高信号/背景比(S/B)(5以上)的成像方式是非常需要的。然而，大多数报道的脑肿瘤PA成像病例是基于低S/B的NIR-I PA造影剂，导致难以精确定位脑肿瘤。
在这篇文章中，作者报道了NIR-II CP NPs通过头皮和头骨对脑肿瘤进行靶向PA成像和图像引导PTT。作者使用具有强烈NIR-II吸收的D-A结构CP，通过简单的纳米沉淀和随后的活性靶向配体环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(mpa)) (c-RGD)化学修饰制备NPs，以选择性靶向肿瘤细胞表面的整合素。测试了其基本光物理性质和激光穿透头皮和颅骨的能力。使用实时光声成像系统在PA成像中系统地评估c-RGD修饰的NPs。
将烷基链接枝的BDT((4,8-双((2-辛基十二烷基)氧)苯并[1,2-b:4,5-b ']二噻吩-2,6-二基)双(三甲基锡烷))作为富电子供体单元和BBT(4,8-双(5-溴-4-(2乙基己基)噻吩-2-基)苯并[1,2-c:4,5-c ']双[1,2,5]噻二唑)作为缺电子受体单元交替聚合，构建平面D-A结构CP (P1)高的给受体强度和平面的主链结构导致了低禁带隙和强的NIR-II吸收，而烷基侧链在普通有机溶剂中具有良好的溶解性。为了将P1转化为治疗性NPs，将P1分子与1,2-二硬脂酰-sn-甘油3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)和DSPE-PEG2000-MAL一起溶解在四氢呋喃(THF)中，并在超声作用下进一步分散在水中。在THF蒸发后，(c-RGD)肽通过Michael加成反应共价修饰在P1 NP表面，该肽能有效靶向在脑肿瘤血管生成血管内皮细胞和胶质母细胞瘤细胞中过度表达的αVβ3整合素受体，生成P1RGD NPs。RGD修饰可以增强肿瘤内NP的摄取，从而改善成像和治疗效果。详细分析显示，45.3%的表面马来酰亚胺基团与c-RGD成功反应。通过透射电子显微镜(TEM)和动态激光散射(DLS)观察，P1RGD NPs的尺寸分别为50 nm和64 nm左右。这些尺寸与TEM和DLS中分别在48和63 nm附近的P1 NPs的尺寸非常相似。P1RGD NPs在1064 nm附近具有宽的NIR-II吸收峰，在水中的消光系数(ε)为22.6 L g−1cm−1。此外，P1RGD NPs和P1 NPs都表现出相似的吸收剖面，这表明c-RGD修饰不影响NPs的光物理性质。
为了研究NIR-II光热效应，采用商用兼容的1064 nm连续激光在不同浓度下照射P1 NPs。用红外摄像机监测了P1 NP悬浮液在辐照下的温度变化。在激光照射(1064 nm, 1 W cm−2)下，P1NP(0.1 mg mL−1)的温度在t = 5 min时迅速升高，并达到一个平台(64.8℃)，表明P1 NPs具有良好的光热转换能力。此外，光热转换效率计算为30.1%。此外，NP悬浮液的光热温度随着P1NP浓度的增加而升高。在光热稳定性方面，作者注意到P1NP悬浮液的吸收光谱在连续激光照射(1064 nm, 1 W cm−2)。此外，P1NP悬浮液可进行可逆光热加热和冷却4个循环，且无明显变化，表明具有良好的光热稳定性。
为了证明1064 nm激光在PTT中优于传统808 nm激光，作者分别检查了两种激光穿透鸡组织、小鼠颅骨和头皮的效率。通过相同厚度的鸡胸组织，1064 nm激光明显比808 nm激光更容易穿透组织。例如，通过2毫米厚的鸡组织，成功保留了1064激光能量的54%左右，而808 nm激光能量仅保留了30%左右。显示了激光通过小鼠颅骨和头皮衰减率的结果。通过小鼠颅骨，1064激光损失14%的光能，808 nm激光衰减20%的光能。同样，通过小鼠颅骨和头皮，1064 nm激光损失了64%的光能，808 nm激光衰减了75%的光能。1064和808 nm激光光衰减率的差异主要是由于1064 nm的活组织吸收远小于808 nm。这些结果表明，1064nm PTT对脑肿瘤的治疗更有效。
在体外PA成像研究中，P1NPs和P1RGD NPs在740~1210 nm范围内表现出相似的强度，这是由于相同浓度下两种不同NPs的吸收相似。此外，利用自制的实时光声成像系统，在1064 nm脉冲激光(10 mJ)照射下，即使在8 mm的鸡胸组织下，也能清晰地成像P1NPs(0.01 mg mL−1)。
在进行体内研究之前，作者检测了两种NPs的细胞摄取、细胞毒性和体外光热治疗。为了评价c-RGD修饰的积极靶向效果，用相同浓度的P1 NPs和P1RGD NPs处理细胞。有意选择3 h的培养时间，以优化主动靶向和被动靶向效果的差异。结果显示，“P1RGD NPs”组的PA信号比“P1 NPs”组高3.5倍，说明c-RGD修饰确实显著促进了肿瘤细胞的摄取。细胞毒性分别根据标准CCK-8试验和溶血分析进行了表征。值得注意的是，U87胶质瘤和bEnd.3细胞的存活率均超过90%。用100µg mL−1 P1RGD NPs处理3个细胞，显示出良好的生物相容性。溶血分析结果显示，0~25µg mL−1不同浓度P1RGD NPs处理后，溶血率维持在1%以下，血液相容性良好。
在体外光热治疗中，使用1064 nm激光诱导局部热疗并杀死癌细胞。CCK-8分析结果显示，单独NP或NIR辐照处理对细胞无伤害。相反，P1 NPs与激光照射一起诱导局部热疗效应，导致严重的细胞生长抑制。此外，由于c-RGD修饰增强了细胞摄取，“P1RGD NPs +激光”组的细胞抑制率高于“P1 NPs +激光”组。在1064 nm激光照射(0.8W cm−2)5 min下，“P1RGD NPs +激光”组的IC50值约为1.70µg mL−1，远低于“P1 NPs +激光”组的2.55µg mL−1，说明RGD修饰对提高光热治疗效果具有重要意义。为了直观地评估体外PTT，分别使用绿发射钙黄素am和红发射碘化丙啶染色活细胞和死细胞。所有对照组均观察到强烈的绿色荧光，表明NPs具有生物相容性，仅用1064 nm激光照射对癌细胞无伤害。“P1RGD NPs +激光”组可见明显的红色荧光，而“P1NPs +激光”组同时出现绿色和红色荧光，说明RGD修饰确实增加了癌细胞内部局部P1RGD NP的浓度，进而导致光热治疗效果的增强。
为了评估体内胶质瘤的靶向性和治疗效果，作者分别使用皮下和原位异种胶质瘤模型，在相同条件下静脉注射P1 NPs和P1RGD NPs，对比评估了光声成像和光热治疗效果。连续监测两种NPs在肿瘤内的分布及由此引起的PA信号变化。静脉注射NP前，未检测到明显的PA背景信号，这是因为在1064 nm附近活组织吸收最小。在不同小鼠静脉注射相同浓度(0.5 mg kg−1)的P1 NPs和P1RGD NPs后，肿瘤PA对比度逐渐升高。
对于皮下肿瘤模型，作者注意到注射后3h, P1RGD NPs组的PA信号几乎达到了P1NPs组的两倍。这表明RGD修饰诱导的主动靶向是体内NP循环初始阶段的主要驱动力。注药3 h后，P1NPs组PA信号增强率较P1RGD NPs组得益于增强渗透性和保留率(EPR)效应提高更快。在该研究实验期间，肿瘤PA信号持续升高，在注射后24 h达到最大值。值得注意的是，注射后24 h, P1NPs组和P1RGD NPs组的S/B分别为52和95。这些结果表明，c-RGD修饰的NIR-II CP NPs具有良好的胶质瘤靶向能力，可持久快速积累，实现高S/B和清晰的肿瘤可视化。
在测试期间，注射后24小时，根据PA成像结果，NP积累达到最大值(1064 nm激光(1 W cm−2)定位于皮下肿瘤。局部激光照射5 min后，“P1RGD NPs +激光”组肿瘤温度从36.8℃迅速升高至52.8℃，而“P1 NPs +激光”组肿瘤温度在5 min内从36.8℃上升至45.8℃，在相同激光照射下，对照组温度仅升高2℃。热成像不仅证实了肿瘤内部CP NPs具有较强的光热转化能力，还证实了P1RGD NP在肿瘤中有效积累。光热处理后进行苏木精和伊红(H&E)染色分析。“P1RGD NPs +激光”组较“P1 NPs +激光”组肿瘤组织损伤更严重，细胞坏死比例更高，而所有对照组均未出现明显的细胞坏死。这些结果表明，P1RGD NPs在1064 nm光热处理下具有有效的肿瘤破坏能力。此外，通过监测肿瘤生长速率和生存率，研究定量PTT疗效。在所有对照组中，肿瘤体积在第18天扩大了约13倍，导致第25天的存活率低于50%。对于“P1 NPs +激光”组，在第35天存活率为50%，第6天肿瘤复发。相比之下，“P1RGD NPs +激光”组肿瘤生长完全被抑制，肿瘤未复发，60天存活率为100%。此外，研究发现所有组均未表现出明显的体重减轻，这表明所有治疗的副作用都可以忽略不计。上述体内实验结果证明P1RGD NPs在1064 nm PTT皮下胶质瘤消融中具有良好的生物相容性和积极的靶向作用。
为了进一步评价NPs的肿瘤靶向作用，用聚(9,9-二己基芴-alt-2,1,3-苯并噻二唑(PFBT)荧光聚合物标记P1RGD NPs，得到P1-PFBT RGD NPs。利用NPs的荧光信号识别NP在肿瘤和邻近正常组织中的分布。这是因为作者的共聚焦显微镜没有配备>800 nm探测器，而PA系统在细胞水平上无法提供与荧光成像相同的分辨率。P1-PFBT RGD NPs的吸收峰分别在465 nm和1064 nm左右，PFBT的典型发射峰分别在560 nm左右。DLS和TEM结果显示NPs呈球形，直径分别在53和50 nm左右。为验证NPs的肿瘤靶向作用，通过小鼠尾静脉静脉注射P1-PFBT RGD NPs (2 mg kg−1)。注射NPs后24 h，切除组织的体外荧光图像进一步显示，NPs在肿瘤组织中积累，而正常组织中粘附的NPs微不足道。显示肿瘤组织中有较强的荧光信号，而相邻正常组织中没有明显的荧光信号。这与体外实验结果一致。除荧光成像外，监测1064 nm激光对肿瘤区域及邻近正常组织诱导的光热温度，以确定NP辅助光热处理是否会对正常组织造成损伤。np注射后24 h，激光照射5 min内肿瘤温度迅速升高至50.8℃，而相邻正常组织在同一时间激光照射后温度略有变化至40.5℃。温度图像进一步显示肿瘤中NP的积累，而正常组织中NP的积累要弱得多。PTT治疗后H&E染色分析显示局部热疗可有效破坏肿瘤组织，细胞坏死，而邻近正常组织无明显损伤。总之，这些结果证实了NPs能够有效地靶向肿瘤，而不是正常组织。
对于原位肿瘤模型，通过颅骨和头皮无创清晰定位脑深部肿瘤对于图像引导手术和治疗具有重要意义。系统注射P1NPs和P1RGD NPs前，生物发光成像显示荧光素酶标记的胶质瘤细胞具有较高的生物活性，而磁共振成像结果显示肿瘤位于颅骨下方3mm处。在研究期间，注射后24小时，NP在肿瘤中的积累达到最大值，PA成像证实。因此，在1064 nm激光照射下，分别在注射P1NPs和P1RGD NPs后24 h对原位脑瘤进行PTT治疗。使用热成像摄像机实时仔细监测大脑温度的变化，因为大脑内部的热能膨胀不仅会对肿瘤产生强烈影响，还会对周围的神经和组织产生强烈影响。特地选择1064 nm激光功率为0.8 W cm−2，照射时间为5 min，以避免PTT治疗后对大脑的直接损伤，并最大限度地发挥光热抑制肿瘤的作用，以最佳地延长PTT治疗后小鼠的寿命。与皮下肿瘤模型光热加热结果相似，连续激光照射5 min时，“P1RGD NPs +激光”组脑温度升高最快，达到48.4℃，而“P1NPs +激光”组为43.6℃，对照组为39.7℃。PTT治疗后，使用荧光素酶标记的胶质瘤细胞连续定量实时监测肿瘤生长。作者注意到，原位肿瘤模型对照组颅内胶质瘤细胞荧光强度增加到治疗前初始值的32倍左右，表明原位胶质瘤具有快速进展的特点。对照组肿瘤生长较快，生存期不足25d。“P1 NPs +激光”组胶质瘤生物发光强度维持到第10天不变，之后逐渐升高，提示肿瘤复发，34天存活率为50%。相比之下，“P1 RGD NPs +激光”组在PTT治疗后的生物发光强度几乎不变，在第40天存活率为50%，是各组中最高的，这与皮下肿瘤模型的结果一致。H&E染色图像显示，“P1 RGD NPs +激光”组肿瘤大小明显小于“P1NPs +激光”组，而对照组原位肿瘤大小明显大于其他各组。值得注意的是，本研究中1064 nm激光的治疗功率(0.8 W cm−2)低于1 W cm−2的安全极限。相比之下，报道的脑肿瘤PTT中使用的808 nm激光功率远高于安全极限0.33 W cm−2。例如，在之前的报告中，1.5 W cm−2用于二氧化硅涂层的金纳米棒，4 W cm−2用于二氧化硅-金纳米壳，16 W cm−2用于金纳米球。这些结果成功地证明了NIR-II PTT的高安全性。综上所述，这些结果表明c-RGD修饰的NPs介导的NIR-II光疗可有效地通过头皮和颅骨抑制脑肿瘤。
静脉注射浓度为5 mg kg−1的P1RGD NP，分别为体内PA成像和PTT治疗注射剂量的10倍和2.5倍，经血液生化检测和组织学分析，NP治疗组与对照组的生化指标无明显变化。此外，在PTT治疗后第18天，H&E染色显示皮下肿瘤模型小鼠主要器官细胞结构未见明显变化。这些结果表明P1RGD NPs具有良好的生物相容性。
结论
综上，作者首先开发了一种有效的脑肿瘤治疗模式，通过头皮和颅骨NIR-II光热疗法，使用主动靶向配体修饰的NIR-II缀合聚合物纳米颗粒，进行精确的光声成像引导。该纳米颗粒具有良好的光稳定性、良好的生物相容性、强的光捕获能力和良好的光热转换性能。与常用的808 nm PTT相比，1064 nm激光穿透头骨和头皮的效率更高，导致治疗所需功率密度低于激光安全极限。作者的实验表明，与使用未修饰的纳米颗粒相比，c-RGD NPs可以实现活跃的脑肿瘤靶向，这进一步导致光声成像对比度显著增加，超高高信号与背景比高达90，并提高了原位脑肿瘤模型的治疗效果。总的来说，光稳定性和生物相容性的NIR-II共轭聚合物纳米颗粒有望通过双光声成像和光热治疗以精确和有效的方式治疗脑肿瘤。
参考文献
Through Scalp and Skull NIR-II Photothermal Therapy of Deep Orthotopic Brain Tumors with Precise Photoacoustic Imaging Guidance. Bing Guo, Zonghai Sheng, Dehong Hu, Chengbo Liu, Hairong Zheng, Bin Liu. Adv. Mater. 2018, 30, 1802591.https://doi.org/10.1002/adma.201802591
