内容提要
在近红外二区(NIR-II；1000-1700 nm)具有最大吸收峰的有机染料引起了人们极大的兴趣。然而，由于缺乏合适的分子支架，目前该领域的研究仅限于菁染料，开发用于生物光子学的吸收近红外二区的有机染料仍然是一个巨大的挑战。在这里，作者合理地设计了一种具有良好J-聚集能力的乙烯桥联BODIPY支架，揭示了桥联乙烯单元是分子间J-偶联调节的关键。通过将给电子基团整合到支架中，作者得到了一种BODIPY染料BisBDP2，其J聚集吸收峰值约为1300 nm。BisBDP2 J-聚集体表现出优异的光热性能，包括强烈的光声响应，以及高达63%的光热转换效率。体内实验结果表明，J聚集体在光声成像和光热消融治疗深层肿瘤方面具有潜在的应用价值。这项研究将加速探索具有近红外二区吸收的J-聚集体，用于未来的生物光子学领域。
结果
分子设计。具有乙烯桥的菁染料通常表现出优异的J-聚集性能。为了确定它是否也适用于BODIPY染料，作者设计了一种乙烯桥联的BODIPY染料(BisBDP1)。作者选择中间位带有三氟甲基的BODIPY染料作为生色团(CF3-BODIPY)来构建BisBDP1。当与在中间位置具有甲基和苯基的经典BODIPY染料相比，由于CF3基团具有优异的吸电子能力，CF3-BODIPY染料典型地表现出深色移位的吸收。这将有助于对BisBDP1的抗体进行深色移位。
另一方面，由于许多乙烯桥联的BODIPY染料与它们的单体相比，表现出100到200 nm的变色位移，因此BisBDP1被高度期望将吸收红移到近红外区。利用CF3-BODIPY高度接受电子的性质，作者进一步开发了(D-A--A-D)结构的BODIPY染料(BisBDP2)，将两个具有很强给电子能力的THQ单元整合到双BDP1支架中，实现了进一步的吸收红移。此外，双BDP2的D-A-p-A-D“之”字型将有助于在聚集态产生分子间的J-耦合；因此，J-聚集体对近红外窗口的红移吸收是非常有希望的。
合成与表征。BisBDP1和BisBDP2及其对应的单体BDP1和BDP2的合成如图所示。用单晶X-射线结晶学表征了BisBDP1的分子结构和堆积结构。在BisBDP1的分子结构中，两个乙烯桥联的吲二烯平面相互规划得很好。值得注意的是，BisBDP1以“头到尾”的方式堆积，滑动角度为27°，每个单体之间的距离约为3.68ä。每个单体通过和C和F之间的分子间相互作用连接。吲哚平面与强C-…的相互作用。F相互作用在J型分子结构的形成中起着关键作用。
稀溶液中的光物理性质。作者研究了BDP1和BDP2以及BisBDP1和BisPDP2在二氯甲烷溶液中的光物理性质。
BDP2在735 nm处显示其抗体，与Meso-CF3-BODIPY核心相比，其红移了191 nm。从THQ单元到BODIPY核心的“推挽”效应应该是造成这种大的偏色移位吸收的原因。与BDP1相比，双BDP1的吸收(abs=760 nm，max=129,000M−1 cm−1)发生了216 nm的红移，这一趋势与已报道的乙烯桥联BODIPY染料相当。值得注意的是，BisBDP2在1112 nm处显示其吸收，与BDP2和BisBDP1相比，BDP2和BisBDP1分别发生了377和352 nm的红移。根据上述结果，扩展的共轭和推挽效应的协同作用导致了超大的偏色位移。值得注意的是，BisBDP2是第一个已知的单体吸收超过1100 nm的小分子BODIPY染料，其设计策略有望为开发吸收近红外II的BODIPY染料提供机会。
与吸收光谱的结果一致，BDP2有一个宽的发射带，其最大发射波长约为995 nm。与BDP1强烈的绿色发射相比，红移和量子产率的降低进一步表明BDP2比BDP1具有更强的分子内电荷转移(CT)本征特性。在788,870和975 nm处分别出现一个尖锐的峰和两个相对较宽的峰，这可能分别归因于局部发射和CT发射。788、870和975 nm分别是局部发射和CT发射。由于扩展的共轭和推挽效应，BisBDP2的发射进一步红移到近红外窗口，其发射约为1314 nm。这些结果进一步证明了推挽效应和共轭效应的协同作用对发射波长红移的重要性。然而，双BDP1和BisBDP2的太低而无法测定，这表明推挽效应导致了强烈的荧光猝灭。
理论计算。通过理论计算可以很好地解释单体和二聚体的光物理性质。计算结果表明，BDP1、BDP2、BisBDP1和BisBDP2的第一吸收带主要由最高占据分子轨道(HOMO)到最低空分子轨道(LUMO)的跃迁贡献，跃迁能与实验结果吻合较好。在HOMO和LUMO中，BDP1和BisBDP1的电子密度主要分布在全分子中，而BDP2和BisBDP2的电子密度分别主要位于HOMO和LUMO中的THQ基团。值得注意的是，BisBDP1和BisBDP2的电子密度位于在HOMO和LUMO中，乙烯桥的总含量约为6%，这使得电子密度在两个吲哚平面上离域，并使禁带宽度变窄。此外，除了BDP2和BisBDP2的分子内CT特征外，LUMO中THQ单元的减少和吲哚平面的贡献增加。注意，BisBDP2的HOMO和LUMO之间的电子密度差小于BDP2，表明BisBDP2的CT特征比BDP2弱。这一趋势与实验结果一致：计算得到的双BDP2的跃迁偶极矩为7.9D，小于BDP2的9.1D。这些结果表明，共轭效应和推挽效应都控制了吸收的大的变色位移。
J-聚集体的光物理性质。在探索J-聚集行为之前，作者首先研究了它们在不同极性的有机溶剂中的光物理性质。BDP1和BisBDP1在除二甲基甲醛(DMF)和二甲基硫(DMSO)以外的大多数有机溶剂中的吸收光谱都很稳定，这可能是因为它们的极性特性相对较弱。在二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中，BDP1优先与低色移位的abs形成H-聚集体，这与大多数BODIPY染料(31，32)的H-聚集行为一致。相反，在这两种极性溶剂中，BisBDP1倾向于形成聚集体，分别产生以873 nm为中心的锐带和以814 nm为中心的肩带，半峰全宽为620 cm−1，半峰宽为2000 cm−1。根据下面的机理研究，尖锐的吸收带应归因于具有高度有序结构的J-聚集体，而宽带应归因于单体的吸收。此外，显著的狭窄和红移的J带表明单体之间的强耦合，导致广泛的激子态。
K-Eg从单体的7.1%增加到J型聚集体的8.2%，进一步证实了这一猜测。此外，根据N=[(FW2/3)M/(FW2/3)J]2的公式估算J-聚集体的相干长度N=10，而(FW2/3)M和(FW2/3)J是单体和J-聚集体吸收带的三分之二的全宽。作者还研究了BisBDP1在甲苯-DMF二元溶剂中的聚集行为，其中甲苯为良好溶剂，DMF为不良溶剂。随着甲苯中DMF馏分(FD)的增加，以769 nm为中心的单体吸收带逐渐减小，J-聚集体吸收带逐渐增加。FD=99%时的吸收光谱与DMF溶液中的吸收光谱基本相同，进一步证实了J-聚集体的形成。可能是因为BDP2在所有有机溶剂中都有很好的溶解性，所以它保持了单体状态，随着有机溶剂极性的增加，其吸收带略有红移。相反，BisBDP2在甲醇和乙醇中倾向于J-聚集体，J-聚集体的labs分别在1350 nm左右。与单体相比，在乙醇中形成的J-聚集体的mEg从6.8增加到8.0，半高宽从1 90 0缩窄到1 410 cm−1，这进一步表明了J-聚集体的形成。在甲醇和乙醇中的估计相干长度(N)分别为≈4和2。N值小于BisBDP1的原因可能是由于长链烷基链和分子结构的增加导致了分子运动的增加。此外，BisBDP2还表现出预期的J-聚集在四氢呋喃(THF)-乙醇二元溶剂中，四氢呋喃(THF)为优良溶剂，乙醇为劣溶剂。在四氢呋喃溶液中加入乙醇后，随着乙醇体积分数(Fm)从0增加到99%，单体在112 5 nm处的吸光度(FWHM=2 6 0 0 cm−1)逐渐减小，并在1 375 nm附近出现一个新的J带，半高宽为14 0 0 cm−1。1125 nm处的吸收峰和1365 nm处的吸收带仍然存在，即使FM达到99%。这一结果与在乙醇中观察到的单体吸收带一致，表明单体中的推拉效应和分子间J耦合都有助于BisBDP2 J聚集体的吸收。与在四氢呋喃-乙醇二元溶剂中得到的结果类似，在四氢呋喃-水二元溶剂中也观察到了BisBDP2的J-聚集行为。在四氢呋喃溶液中加入水，在1276 nm附近产生了一个新的J-聚集峰，与在四氢呋喃-乙醇二元溶剂中的J-聚集峰相比，J-聚集峰略有减色移动。由于水比乙醇更具极性，所以BisBDP2中的非极性长烷基链更容易从水中解离，这可能导致BisBDP2在四氢呋喃-水中的J-聚集体结构比在四氢呋喃-乙醇中更疏松。J-聚集体形成的低极性环境可能会抑制CT效应，导致亚色移位吸收。与在DMF、DMSO和甲苯-DMF二元溶剂中良好的J-聚集行为不同，在水含量达到99%的四氢呋喃-水二元溶剂中，BisBDP1倾向于形成H-聚集体。这一结果表明，在四氢呋喃-水二元体系中，BisBDP1的J-聚集体很难稳定，而BisBDP1分子更有可能产生动力学控制的H-聚集体。接下来，作者还考察了盐对BisBDP1和BisBDP2在水溶液中J-聚集的影响。S8和S9的吸收光谱几乎不随盐浓度的增加而变化。而由于盐析效应的影响，BisBDP2聚集体的吸收强度逐渐降低。因此，氯化钠对BisBDP1和BisBDP2的J-聚集行为没有促进作用，这可能是由于它们的中性化学结构所致。在荧光光谱中，BisBDP1和BisBDP2的J-聚集体表现出很弱的荧光，em在982和1331 nm附近，但J-聚集体的f太低而无法测定。分子内CT效应和分子间堆积可能是猝灭荧光的主要原因。
J-凝聚机理研究。作者进行了依赖于温度的紫外-可见(UV-VIS)-近红外光谱测量和形态研究，以深入了解J-聚集体的机理和结构细节。随着温度从283K升高到343K，在DMF和乙醇中，BisBDP1和BisBDP2的J带逐渐减少，伴随着单体吸收带的增加。当温度达到343K时，J-带消失，只能观察到单体的吸收带，表明J-聚集体与单体完全解离。值得注意的是，BisBDP1和BisBDP2的肩带在814和1125 nm附近的吸光度并没有随着温度的升高而降低。相反，这两个肩带逐渐减色并最终转换为单体吸收带。这一结果表明，这两条带应归因于单体吸收而不是没有长程有序的聚集体。作者用成核-伸长模型研究了BisBDP1和BisBDP2(30，50)的聚集过程。通过对所获得的聚集分子分数(Agg)随温度(T；Fig.。S11)时，聚合反应的摩尔热(He)和伸长温度(Te)分别为−23.4kJ−1和340K，−为50.0kJ moL−1和343K。BisBDP2的He比BisBDP1低，这说明BisBDP2比BisBDP1更倾向于聚集。
作者用原子力显微镜进一步表征了J-聚集体的形态。将BisBDP1聚集体的DMF溶液滴铸到硅片表面，得到了长度为880±260 nm，宽度为240±25 nm，高度为4.5±0.3 nm的棒状聚集体。在相同条件下，BisBDP2在乙醇溶液中自组装成长600±160 nm、宽350±40 nm、高1.2±0.1 nm的圆形饼状聚集体。BisBDP2较大的共轭结构和长链烷基链引起的分子内运动和排斥效应可能解释了BisBDP1和BisBDP2在形态上的不同。此外，这些结果进一步揭示了BisBDP1分子比BisBDP2分子更有可能聚集成长程分子结构，这与在吸收光谱中获得的估计相干长度值是一致的。
J-聚集体的光热和PA性质。鉴于上述发现，双BDP2的J-聚集体可能被证明是有效的吸收近红外-II的PA成像和光热试剂，因为它们在1200 nm以上表现出强吸收和极低的荧光量子产率(2，51)。不幸的是，较差的荧光性质使得BisBDP2 J-聚集体不适合用于荧光成像。接下来，作者研究了BisBDP2 J-聚集体的PA和光热性质。为了获得良好的稳定性和长时间的血液循环，作者将BisBDP2 J-聚集体包裹到Pluronic F-127基质中，得到了水溶性的BisBDP2纳米粒(5，34)。作者发现，2-3 mg/ml的浓度范围是制备所需NPs的最佳浓度。透射电子显微镜和动态光散射分析表明，这些纳米粒子呈球形，直径约为100 nm。较小的尺寸通过增强渗透性和滞留效应赋予了BisBDP2纳米粒的肿瘤累积潜力(52)。BisBDP2纳米粒子在1273 nm处显示abs(max=93000 M−1 cm−1)，这与在四氢呋喃-水二元溶剂中得到的结果一致。这一结果表明，BisBDP2 J-聚集体在Pluronic F-127基质中稳定得很好。值得注意的是，双BDP2纳米粒子的高emax与已报道的基于花菁和方碱的J-聚集体(7，26，28)相当，显示出有效的光吸收能力。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中，BisBDP2纳米粒子表现出高效的光热转化能力。在1208 nm(0.8W cm−2)激光照射10分钟后，溶液温度从28°C显著上升到62°C(T=34°C)。
根据温度变化曲线，计算出光热转换效率为63%，与已报道的基于有机小分子(4，5，53)的近红外光热剂的光热转换效率相当。此外，温度BisBDP2纳米粒子的增量与激光功率密度和纳米粒子的浓度呈正相关，表明可控的光热转化行为。此外，五次加热和冷却循环证明了BisBDP2纳米粒子的高热稳定性。在甲苯中的吸收光谱和在PBS中的吸收光谱在连续1h的激光照射下基本保持不变，这表明BisBDP2有机分子和BisBDP2纳米颗粒具有良好的光稳定性。此外，BisBDP2纳米粒子分别在PBS缓冲液和胎牛血清中保存8小时后，UV-VIS-NIR光谱基本保持不变，也证明了它们的高度稳定性。
研究发现，BisBDP2纳米粒子具有优异的光热转换性能，因此，它们应该被应用于激光照射下产生功放信号。因此，作者评估了体外PA成像能力。当1260 nm激光照射双BDP2纳米颗粒的水分散体时，检测到来自纳米颗粒的实际声波。由此得到的功率谱显示了NIR-II窗口中强烈的功率放大器信号，并很好地反映了吸收光谱。这一结果表明，J-聚集体对NIR-II的强烈吸收控制着PA的反应。此外，观察到良好的相关线性的BisBDP2 NP浓度与PA强度。因此，良好的PA响应行为确保了BisBDP2纳米粒子有可能用于指导体内PTT。
体外光热性能。由于近红外光对水的吸收和热效应，808 nm和1064 nm激光目前通常用于近红外I和II的光声和光热实验窗口。目前尚不清楚波长更长的激光是否可以用于活体实验。在这项研究中，作者研究了不同波长的激光在不同厚度的水和组织中对功率密度衰减的影响(54)，发现1208 nm激光在组织中具有最小的功率衰减系数(=0.586)，与1064 nm(=0.652)和808 nm(=0.957)激光相比。作者通过用不同的激光照射BisBDP2纳米粒子，进一步评估了BisBDP2纳米粒子在不同厚度的组织中的光热转换能力。在高达43摄氏度的温度下，正常组织只会受到轻微的影响，这种温度能够摧毁肿瘤(55-57)。以43℃为参考温度，分别用808 nm、1064 nm和1208 nm激光照射BiBDP2纳米粒子，组织厚度分别为2、6和8 mm。作者还证明了NIR-I光热剂TFM-BDP(58)具有88.3%的高光热转换效率，当组织深入材料5 mm时，可以达到43℃的温度。根据这些结果，可以得出结论，与1064 nm和808 nm激光相比，1208 nm激光在组织中具有更好的穿透深度。因此，作者选择了1208 nm激光作为后续体内和体外实验的光源。
接下来，作者研究了BisBDP2纳米粒子在活细胞上的PTT性能。从0到50mM的不同浓度的BisBDP2纳米粒对MCF-7、HeLa和HepG2细胞的毒性可以忽略不计，表现出良好的生物安全性。在1208 nm激光照射后，大约90%的细胞可以通过光热效应被有效地杀死。作者还利用荧光成像实验评估了纳米粒子对细胞存活的光热效应。
通过钙黄素AM和碘化丙啶染料与癌细胞的共染色，发现对照组、对照组+光照组和NP组的细胞呈现绿色荧光，表明这些细胞处于正常的活状态。然而，与NPs孵育的细胞在激光照射10min后显示红色荧光，这表明激光激活NPs产生的热能有效地杀死了细胞。所有这些细胞结果证明了BisBDP2纳米粒子良好的生物相容性和高效的PTT性能。
作者进一步研究了BisBDP2纳米粒在正常小鼠体内的药代动力学。血药浓度-时间曲线表明，BisBDP2NPs的浓度在早期迅速衰减，计算出血液循环半衰期为7.4h，清除速率为8.0L/h−-1。这些结果表明，BisBDP2纳米粒具有良好的体内药代动力学性能。
活体PA成像。上述阳性的体外实验结果促使作者研究了BisBDP2纳米粒子的体内深部组织PTT性能。作者建立了小鼠原位肝细胞癌模型，并经荧光成像证实。在PTT检查之前，作者评估了体内PA成像能力。
最初，荷瘤肝脏部位在1260 nm处显示的PA信号可以忽略不计，这表明了超过1200 nm的PA成像的优势，可以有效地避免血红蛋白(59)产生的PA信号干扰。尾静脉注射100M和150l的BisBDP2纳米粒后，肿瘤部位的PA信号强度在注射后6小时逐渐增加到最大，然后逐渐降低。此外，作者还处死荷瘤小鼠，并通过PA成像对主要器官进行成像，以研究BisBDP2 NPs的分布。在肿瘤中观察到的PA信号大约是心脏、脾、肾和肝脏的2.5、2.1、5.0和2.1倍，证明了NPs在肿瘤中的高效积累。为了比较，作者还进行了正常小鼠的PA成像实验。在没有BisBDP2纳米粒子的情况下，正常小鼠肝脏部位的PA信号也可以忽略不计，但PA信号强度在注射1h后明显增加，达到最大值。这一结果表明，在荷瘤组观察到的PA信号位于肿瘤部位，进一步验证了BisBDP2纳米粒的肿瘤靶向性和PA成像能力。
体内PTT。在上述PA成像结果的基础上，作者对荷瘤小鼠进行了PTT实验。小鼠尾静脉注射含PBS溶液的BiBDP2NPs，激光照射波长为1208 nm(0.8W cm−2)。小鼠肝脏温度从30°C到49°C随时间增加到10min呈逐渐升高的趋势。然而，只注射PBS的对照组小鼠的体温从30°C略有上升到36°C。这些结果证明了纳米粒子在体内具有可靠的光热转化性能。接下来，作者将这些肝肿瘤荷瘤小鼠随机分为四组(PBS组、PBS+1208 nm激光组、BisBDP2 NPs组、BisBDP2 NPs+1208 nm激光组)，并通过荧光成像监测肿瘤大小。在为期16天的治疗中，PbS、PbS+1208 nm激光和BisBDP2 NP组的相对肿瘤信号呈线性增加，最终体积约为初始体积的4倍，表明肿瘤的快速增殖。相比之下，BisBDP2纳米粒子+1208 nm激光组的相对肿瘤信号从1.0逐渐减少到0.95，显示出对肿瘤增殖的有效抑制作用。此外，组织解剖学结果表明，在所有四组中，肿瘤的体积是最小的，这与生物成像实验中观察到的结果是一致的。在治疗过程中，四组小鼠体重稳定，进一步表明BisBDP2纳米粒具有很高的生物相容性。此外，作者通过苏木素和曙红(H&E)评估肿瘤细胞的凋亡。和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷缺口末端标记(TUNEL)。染色。心、肾和肺中的细胞在四组中的变化可以忽略不计，证明了NPs的最小毒性。值得注意的是，在BisBDP2纳米粒子+1208 nm激光组中，肿瘤细胞中的坏死区可见，而在其他组中则看不到。
这些结果表明，BisBDP2纳米粒在NIR-II窗口具有良好的生物安全性和良好的体内PTT效果。
讨论
作者设计并合成了供体-受体结构的乙烯桥联BODIPY染料，用于产生J-聚集体abs超过1,200 nm。在二氯甲烷溶液中，亚乙基桥联BODIPY染料在1100 nm处出现-abs，这表明结合推拉和共轭效应可以设计吸收NIR-II的BODIPY染料。此外，BODIPY二聚体的锯齿状结构赋予了在有机二元溶剂中有效的J-聚集行为，导致abs在约1300 nm处进一步红移。值得注意的是，J-聚集体可以在水溶液中生成并稳定在Pluronic F-127聚合物基质中。在1208 nm激光(0.8W cm−2)照射下，J聚集体表现出很弱的荧光，有利于获得高达63%的PCE值。体外和体内研究表明，NIR-II PA具有良好的生物相容性、肿瘤诊断能力以及对原位肝细胞癌的高PTT性能。因此，作者的研究结果表明，乙烯桥联的BODIPY染料的J-聚集体很有希望成为开发吸收NIR-II的光热试剂的支架，本研究为探索用于生物光子学应用的有机NIR-II吸收试剂提供了一种替代策略。
参考文献
Discovery of BODIPY J-aggregates with absorption maxima beyond 1200 nm for biophotonics. Xiaoqing Wang, Zhiyong Jiang, Zhaolun Liang, Tianzhu Wang , Yuncong Chen, Zhipeng Liu. Sci. Adv. 8, eadd5660 (2022). https://doi.org/10.1126/sciadv.add5660
