内容提要
类风湿性关节炎(RA)是一种以关节炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。巨噬细胞通过不断的细胞积累和细胞因子的分泌，加速RA的病理过程。因此，巨噬细胞的多尺度可视化对RA的早期诊断具有重要意义。在这项工作中，开发了叶酸受体靶向的Cptnc-4F纳米探针，命名为FA-CF-NPs，用于RA小鼠模型巨噬细胞的双模型分子成像。FA-CF-NPs具有互补的成像优势，在第二近红外窗口(NIR-II)具有较高的荧光灵敏度和分辨率，并且具有良好的光声(PA)成像与深部组织穿透的对比度。FA-CF-NPs表面的叶酸配体对叶酸受体过表达的巨噬细胞具有高亲和力，确保了纳米探针在体内成像的特异性靶向功能。利用FA-CF-NPs实现NIR-II荧光成像，准确定位关节内巨噬细胞，获得15.5的高信本比(SBR)。同时进行PA成像，观察全关节纵切面巨噬细胞分布。此外，在没有滑膜炎和软骨丢失等RA病理的小鼠关节中检测到巨噬细胞浸润。该结果为RA的体内巨噬细胞追踪和早期诊断提供了机会。
结果与讨论
FA-CF-NPs的表征
Cptnc-4F (CF)是一种疏水小分子染料，具有强吸附性和NIR-II FL发射。为了制备负载cf的叶酸靶向纳米探针(FA-CF-NPs)，采用纳米共沉淀法。然后，进行了一系列实验来表征所获得的FA-CF-NPs的形貌、尺寸和光学性质。透射电镜(TEM)成像显示，制备的FA-CFNPs为球形，平均直径为7.2±1.3 nm。动态光散射(DLS)检测到FA-CF-NPs的水动力直径为8.9±2.4 nm，与TEM结果一致。FA-CF-NPs尺寸的增加源于水层和PEG层的水动力尺寸。FACF-NPs的光物理测量结果显示，最大吸收波段从802 nm红移到901 nm。同时，荧光发射波段也出现了928 ~ 941 nm的红移。与游离CF相比，在1031 nm处出现了一个新的荧光发射峰。说明CF被加载到纳米胶束疏水核心后，有利于分子聚集，导致荧光中心发射带红移至NIR-II区。这使得FA-CF-NPs相对于游离CF具有更好的NIR-II FL成像电位。因此，制备的FA-CF-NPs表现出浓度依赖性的NIR-II FL发射，在3.1 ~ 50µg mL−1范围内呈良好的线性关系(R2 = 0.99）。此外，在4℃条件下，FA-CF-NPs在28天内未发生沉淀和水动力直径变化，表明胶体稳定性良好。
FA-CF-NPs的体外活性靶向成像
巨噬细胞作为一种免疫细胞，通过在关节组织中聚集和分泌细胞因子，在RA的进展中起着至关重要的作用。叶酸受体β (FRβ)在活化的巨噬细胞表面高度表达，为特定分子成像提供了极好的候选靶点。因此，为了验证FA-CF-NPs的活性靶向能力，引入脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞(RA W264.7细胞)产生高表达水平的FRβ。Western blot (WB)分析显示，lps处理的RA W264.7细胞中FRβ的表达水平高于未处理的细胞。这一结果与先前报道的数据一致，表明LPS可诱导RA W264.7巨噬细胞过表达FRβ。接下来，利用lps诱导的RA W264.7巨噬细胞进行荧光成像，评估FA-CF-NPs的主动靶向能力。由于商用荧光共聚焦显微镜和流量分析仪没有CF检测通道，本实验采用吲哚菁绿(ICG)代替CF来验证FA-CF-NPs的体外靶向能力。共聚焦荧光成像显示，lps处理2 h后，FA-ICG-NPs主要分布在RA W264.7细胞的细胞质中。FA-ICG-NPs处理组的荧光强度高于其他三组(ig - nps处理组、FA-ICG-NPs + fat处理组和对照组)。定量流式细胞术显示，faicg - nps处理组的平均荧光强度(MFI)分别比icg - nps处理组和FA-ICG-NPs + fa处理组高1.9倍和2.9倍。相比之下，对于非活化的RA W264.7细胞，FAICG-NPs组和ICG-NPs组之间的细胞摄取没有显著差异。总之，这些结果表明FA-CFNPs可以通过fr β介导的内吞作用积极靶向lps处理的RA W264.7细胞。
CIA小鼠模型FA-CF-NPs的体内NIR-II荧光成像
受制备的FA-CF-NPs良好的体外活性靶向能力的启发，作者分别使用NIR-II FL成像和PA成像进一步评估CIA小鼠模型的体内活性靶向性。采用临床评分，反映红肿程度和受累关节数。结果显示，与正常小鼠相比，强化注射后CIA模型小鼠关节炎症状逐渐加重。
与正常小鼠相比，CIA模型小鼠前爪呈红肿状。苏木精伊红(H&E)染色分析显示CIA模型小鼠足关节出现滑膜炎症，关节面塌陷，关节结构不清。红- o和快绿(Saf-O)染色结果显示，模型组小鼠爪关节软骨相对于正常组有明显的缺损。
此外，小鼠前爪免疫荧光染色显示，与正常小鼠关节相比，RA模型的病灶处积累了大量高表达FRβ的巨噬细胞。这些结果表明，成功构建了具有RA特征的CIA模型小鼠，高表达FRβ的巨噬细胞在炎症区大量聚集。
随后，作者利用NIR-II FL分子成像技术评估了FACF-NPs在CIA小鼠模型中的主动靶向能力。FA-CF-NPs处理组小鼠感兴趣区(ROI) NIR-II MFI随时间逐渐升高，最终在48 h达到峰值。测量到的信号背景比(SBR)为15.5，为RA的详细信息的敏感可视化提供了巨大的潜力。而cf - nps处理组荧光信号较弱，正常小鼠脚掌荧光微弱。流式细胞术检测FA-CF-NPs在体内对浸润巨噬细胞的靶向性。作者将实验分为四组:(I) FA-ICG-NPs + CIA小鼠;(II) ICG-NPs + CIA小鼠;ⅲ组:游离FA + FA- icg - nps + CIA小鼠(阻断组);(IV) FA-ICG-NPs +正常小鼠(对照组)(由于商用荧光图像分析仪没有NIR-II荧光检测通道，所以用吲哚菁绿代替CF)。CIA小鼠爪中提取的巨噬细胞表面FRβ表达量(≈88.8%)高于正常小鼠爪中提取的巨噬细胞(≈1.9%)。(I)组ICG的荧光强度明显高于(II) - (IV)组。结果表明，FA-CF-NPs在CIA小鼠爪中具有主动靶向浸润巨噬细胞的作用。上述结果提示FA-CF-NPs具有高效的主动靶向性，可用于RA的高灵敏度影像学诊断。
CIA小鼠模型FA-CF-NPs的体内PA成像
与NIR-II FL成像相比，PA成像具有断层扫描、深层组织穿透和功能成像的优势。因此，作者进一步采用PA成像技术评价FA-CF-NPs在CIA小鼠模型中的靶向性能。作者首先获得了FA-CF-NPs的PA光谱(760 - 920nm)，以确定最佳激发波长。结果显示，最强的PA信号出现在800 nm处。此外，PA信号强度与浓度(CF)在25 ~ 200µg mL−1之间呈良好的线性关系(R2 = 0.99)。
然后，作者估计了FA-CF-NPs在CIA小鼠模型中的PA成像能力。作者将小鼠分为三组(每组3只):I) CIA小鼠+ FA-CF-NPs, II) CIA小鼠+ CF-NPs, III)正常小鼠+ FA-CF-NPs。静脉注射48 h后，(II)组与(III)组之间PA信号强度无明显差异，但(I)组在ROI处产生较强的PA信号，强度为(II)组的5.8倍。此外，PA断层成像显示，测得成像深度约为1.3 mm，能够穿透小鼠整个关节，提供巨噬细胞分布的纵向信息。NIR-II荧光图像(点状斑点信号)与PA图像(爪子全区域信号)模式不同的原因是成像原理和成像分辨率不同。NIR-II荧光成像依赖于纳米探针，具有高分辨率和低背景。光声成像不仅依赖于纳米探针，而且受内源性血红蛋白的影响，显示低分辨率和背景信号。
早期CIA小鼠模型巨噬细胞的体内NIR-II FL成像
作者进一步验证了在早期CIA小鼠模型中巨噬细胞高敏感NIR-II FL成像的潜力。首先建立早期RA小鼠模型，并通过以下一系列表征来评估模型的有效性。早期CIA小鼠的前爪与正常小鼠的前爪没有差异。H&E、Saf-O染色未见关节赘肉、骨破坏等病理改变。早期RA小鼠的病理评分和关节软骨厚度与正常小鼠没有差异。然而，免疫荧光染色结果显示，与正常小鼠相比，早期CIA小鼠模型的关节中检测到明显的绿色(巨噬细胞)和红色(FRβ)荧光。提示小鼠病灶内浸润的巨噬细胞丰富，无结构和病理改变，为早期诊断RA提供了靶向巨噬细胞的可行性。
接下来，作者利用NIR-II荧光成像技术在早期CIA小鼠模型中对FA-CF-NPs进行成像，该技术在深层组织中具有高灵敏度和高分辨率。结果，在静脉注射12小时后，facf - nps处理组在早期CIA小鼠模型前爪的手腕、掌指关节和指尖关节区域显示出明亮的NIR-II FL信号。FA-CFNPs组的SBR为14.1。而cf - nps处理组(SBR = 1)未观察到明显的NIR-II荧光信号。24 h时，两组荧光信号差异最大，处于最佳状态。综合以上结果，提示FA-CF-NPs的NIR-II FL分子显像可以在组织和病理改变前显示病变部位巨噬细胞的变化，对RA的早期诊断具有很大的潜力。
FA-CF-NPs的体内生物相容性
良好的生物相容性是制备纳米探针临床转化的必要前提。为此，作者使用CCK-8试剂盒测定FA-CF-NPs的细胞毒性。结果表明，不同浓度的FA-CF-NPs (Cmax = 500µg mL−1)分别作用12 h和24 h后，HL-1细胞的细胞活力均保持在85%以上，表明FA-CF-NPs具有较低的细胞毒性。接下来，作者进一步评估了FA-CF-NPs对正常小鼠的急性生物毒性。CF静脉注射剂量为2mg kg - 1，是体内显像剂量的2倍。
在静脉注射FA-CF-NPs后，作者分别于第1、4、7天采集小鼠血液进行血液学和生化分析。所有指标均在参考范围内(黄色区域突出显示)，说明该剂量不会对小鼠产生急性毒性。最后，作者在小鼠静脉注射FA-CF-NPs后的第1、4、7天对其实施安乐死，并收集主要脏器进行H&E染色分析。观察到，这些样品中没有炎症、出血或核溶解，表明2mg kg - 1剂量的CF不会引起小鼠器官损伤。此外，作者进行了溶血实验，结果表明，在浓度为250µg mL−1时，FA-CF-NPs的溶血率低(4%)。综上所述，FA-CF-NPs在体内具有良好的生物相容性。
结论
总之，作者成功制备了叶酸靶向NIR-II FL和PA双模型纳米探针(FA-CF-NPs)，用于CIA小鼠模型巨噬细胞的可视化。采用纳米共沉淀法一步制得FA-CF-NPs。此外，它们具有优异的NIR-II荧光发射性能和优异的PA对比度性能，并且具有良好的稳定性。构建的FA-CF-NPs可以通过叶酸和叶酸受体的相互作用特异性识别巨噬细胞，巨噬细胞是RA的重要生物标志物。体内成像结果表明，FA-CF-NPs不仅能在体内实现高SBR巨噬细胞的NIR-II FL成像，还能对小鼠前爪进行深穿透层析PA成像。最重要的是，FA-CF-NPs可用于监测RA早期巨噬细胞的变化。本研究是第一个利用NIR-II FL在小鼠模型中早期诊断RA的成功案例，在RA及其他相关疾病的诊断中具有很大的临床潜力。然而，FA-CF-NPs仍然存在局限性，因为它们不能对疾病产生反应。因此，开发能够进一步降低背景噪声的ra响应纳米探针是一个重要的研究方向。
参考文献
Folate Receptor-Targeted NIR-II Dual-Model Nanoprobes for Multiscale Visualization of Macrophages in Rheumatoid Arthritis. Ruodan Lan, Jianxun Lv, Duyang Gao, Dehong Hu, Chunchen Liu, Jie Jia, Hairong Zheng, Chengbo Liu,* Ping Zhao,* and Zonghai Sheng* .Adv. Funct. Mater. 2023, 33, 2300342. https://doi.org/10.1002/adfm.202300342.
