内容提要
虽然光热疗法(PTT)由于避免了抗生素的滥用而成为耐药细菌感染的一种有前景的治疗方法，但限制治疗效率的其他挑战是感染病变的靶向性差和对革兰氏阴性菌细胞膜的渗透性低。在此，作者开发了一种仿生中性粒细胞样聚集诱导发射(AIE)纳米机器人(CM@ AIE NPs)，用于精确的炎症部位归巢和有效的PTT效果。由于其表面负载的中性粒细胞膜，CM@AIE NPs可以模拟源细胞，从而与免疫调节分子相互作用，否则将靶向内源性中性粒细胞。AIE发光源(AIEgens)具有二次近红外吸收和优异的光热特性，可以实现在炎症部位的精确定位和治疗，从而最大限度地减少对周围正常组织的损伤。此外，CM@AIE np介导的PTT在体内通过980 nm激光照射刺激，有助于治疗深度的程度，限制了对皮肤组织的损伤。良好的生物相容性和优异的体内外抗菌效果证明CM@AIE NPs可为广谱抗菌应用提供策略。
结果与讨论
CM@AIE NPs的合成与表征
作者的报告显示了NIR-II PTAAIE分子BBT-C6T-DPA(OMe)的结构和表征结果。为了更好地了解BBT-C6T-DPA(OMe)分子的特性，利用密度泛函理论计算了分子前沿轨道上的电子云。最低未占据分子轨道(LUMO)的电子云主要位于苯并[1,2-c:4,5-c ']二([1,2,5]噻唑)(BBTD)单元上，而BBT-C6T-DPA(OMe)的最高已占据分子轨道(HOMO)在主链上进行了癸化。HOMO和LUMO之间的能隙为1.31 eV，有利于较长波区的强吸光度。以两亲共聚物(DSPE-PEG2000)为掺杂基体，采用纳米沉淀法合成AIE纳米粒子，研究了NIR-II PTA-AIE分子在形态水平上的光热特性。从BALB/c小鼠骨髓中分离的中性粒细胞细胞膜(CM)被用来包裹AIE NPs，形成CM@ AIE NPs。利用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)方法对CM@AIE NPs进行形貌和尺寸分析。通过TEM图像鉴定了CM在AIE NPs表面的涂层，与裸露的AIE NPs相比，CM@AIE NPs表面清晰地显示出膜层。DLS测量显示CM@AIE NPs的平均尺寸约为102.4 nm。CM@AIE NPs和AIE NPs的Zeta电位值分别为- 8.3 mV和8.9 mV，这可能与负电荷CM的负载有关。采用Western blotting (WB)验证CM包被AIE NPs后功能性蛋白标记的存在。CD11a和CD11b可以调节炎症中的粘附和信号转导过程。β2整合素与白细胞的迁移能力有关。在CM和CM@AIE NPs样品中可以看到相同的特异性蛋白，表明CM在包被步骤后成功保留了生物活性。
为了研究CM@AIE NPs对细胞因子激活的成纤维细胞的粘附能力，将AIE NPs包被DiDlabeled CM(红色荧光)，并与成纤维细胞共培养。提取红细胞(RBC)膜，用DiD标记，并涂覆在AIE NPs上。获得的RBC@AIE NPs作为阴性对照，因为它们与CM@AIE NPs具有相似的形态，但对炎症部位的靶向能力较弱。显微镜图像显示，与CM@AIE NPs孵育的成纤维细胞(L929细胞)和小鼠脐静脉内皮细胞(MUVECs)出现较强的红色荧光，而RBC@AIE NP处理的红色荧光可忽略。这些结果表明CM@AIE NPs对细胞因子激活的成纤维细胞具有良好的靶向能力，可用于抗炎治疗。此外，NPs与促炎细胞因子的结合能力测定显示，CM@AIE NP处理后，剩余的游离肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素-1β (IL-1β)逐渐减少，表明与RBC@AIE NPs相比，CM@AIE NPs可以有效地与促炎细胞因子结合。这一现象主要归因于中性细胞成员中的一些特征性蛋白，这些蛋白可以结合IL-1β和TNF-α。流式细胞术分析显示，与RBC@AIE NP孵育相比，CM@AIE NP孵育后活化的L929细胞和MUVECs的平均荧光强度显著增加。在4℃条件下保存7天后，对CM@AIE NPs的稳定性进行了评价，粒径没有出现明显差异，说明CM@AIE NPs在水中或小鼠血液中都有很好的稳定性。
CM@AIE NPs在约980 nm处有很强的吸收，表明CM@AIE NPs在NIR-II区域的PTT应用中具有很大的潜力。此外，对CM@AIE NPs在不同功率密度下的光热转换能力进行了评价，结果表明，NIR-II激光在0.7W/cm2，表明CM@AIE NPs可以有效地将光能转化为热能。通过5次“ON/OFF”循环验证了CM@AIE NPs的光热稳定性，其具有良好的加热和冷却能力。研究了NIR-II在0.70W/cm2激光辐照下CM@AIE NP溶液(250 μg/mL)在通过红外摄像机进一步确认，显示温度在10 min内逐渐升高，并在5个周期内保持稳定的高温。测得CM@AIE NPs光热转换效率为28.94%。因此，这些结果表明CM@AIE NPs将是一种有效的PTT局部加热剂。为了探索980 nm激光波长对深层组织的光热加热能力，将CM@AIE NP溶液均匀分散在覆盖有预测厚度的鸡胸组织的96孔板上，用NIR-II激光(980 nm, 0.7W/cm2)持续10分钟。在980 nm激光照射后，CM@AIE NP溶液的温度随组织厚度的增加而降低。值得注意的是，根据活体小鼠的平均体温(麻醉时≈30℃)，在最大组织厚度为5 mm的情况下，检测到20.3℃的升高，这表明所获得的温度增量足以达到PTT的阈值温度(43℃)，从而在体内消灭细菌。
CM@AIE NPs的体外生物相容性
CM@AIE NPs的生物安全性需要系统评估后才能用于临床应用。因此，采用红细胞测定不同浓度CM@AIE NPs的体外血液相容性。CM@AIE np孵育组红细胞形态均为正常圆形，与PBS孵育组相似。此外，CM@AIE NPs (250 μg/mL)的溶血率分析为2.2%，远低于标准要求(5%)，说明其具有良好的血液相容性。然后，用MTT法测定CM@AIE NP孵育L929细胞的活力。在250 μg/mL的浓度下，细胞存活率高达90%，表明CM@AIE NPs对L929细胞具有良好的细胞相容性。通过钙黄蛋白AM /碘化丙啶(PI)染色法进一步评估CM@AIE NPs对巨噬细胞的毒性。此外，作者还用显微镜检测了L929的形态。PI被广泛用作商用死菌荧光探针，具有红色荧光，而活菌被钙黄蛋白- AM染色具有绿色荧光。CM@AIE NP (250 μg/mL)处理组的强绿色荧光表明CM@AIE NPs不诱导巨噬细胞毒性。因此，这些结果证明了CM@AIE NPs在细胞水平上的安全性和高生物相容性。
CM@AIE NPs体外抗菌活性研究
受CM@AIE NPs优异的光热转换能力的启发，作者进一步研究了NIR-II激光照射下CM@AIE NPs基于ptt的体外抗菌性能。选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌模型。实验分为五组:(I) PBS， (II) AIE NPs， (III) CM@AIE NPs， (IV) AIE NPs +激光，(V) CM@AIE NPs +激光。用单个AIE NPs或CM@AIE NPs处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出与PBS组相当的高存活率。然而，AIE NPs(4.5%) +激光或CM@AIE NPs(5.6%) +激光治疗后，大肠杆菌的存活率显著降低。AIE NPs +激光和CM@AIE NPs +激光治疗后金黄色葡萄球菌的存活率分别为6.1和6.3%。这些数据表明，np产生的光热效应可以有效地在体外杀灭细菌。CM@AIE NPs +激光照射处理的细菌存活率高于AIE NPs +激光照射处理，部分原因是CM对激光的阻断作用。
为了证实CM@AIE NPs在NIR-II激光照射下的杀菌能力，作者使用AM/PI试剂盒对各种处理后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行染色。PBS组作为对照组。单一AIE NP组和CM@AIE NP组细菌表现出与PBS组相似的强烈绿色荧光，而激光照射后细菌几乎全部死亡，这归因于AIE NP-和CM@AIE NP诱导的PTT。
通过扫描电子显微镜(SEM)检测不同处理后细菌的膜损伤。PBS组作为对照组。对照组和单NP孵育组大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜完整光滑，说明AIE NPs和CM@AIE NPs没有破坏细胞膜的完整性。然而，在激光照射下，出现了严重的细胞膜破坏和细胞内内容物渗漏，这表明AIE NPs和CM@AIE NPs基PTT诱导了有效的抗菌性能。在AIE NPs +激光组和CM@AIE NPs +激光组中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测的TEM测量也显示出类似的细菌损伤结构，与上述结果一致。在CM@AIE NPs +激光治疗下，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的温度变化超过10分钟，由于高热效应，温度变化明显增加。高温可通过使酶失活、使蛋白质结构凝固、抑制DNA复制和中断代谢信号通路，增加细胞膜的通透性并诱导不可逆损伤。当单一NP处理的细菌完全增殖时，测定不同处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落，并设为对照组。在980 nm激光照射下，细菌集落形成明显受到抑制，这可能与PTT基细菌死亡有关。结果表明，CM@AIE NPs在NIR-II激光照射下具有良好的体外抗菌能力。
常见的细菌感染与细菌生物膜的生成密切相关，细菌生物膜的生成往往可导致严重感染，严重者可导致死亡，且生物膜在创面上生长时难以破坏。生物膜是由细菌及其在细菌生长过程中产生的胞外聚合物组成的。因此，消除细菌生物膜保护的细菌是评估CM@AIE NPs +激光治疗生物医学应用的关键参数。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养2天形成生物膜，不同处理后用SYTO 9/PI试剂盒染色。结果表明，PBS和单个NPs处理后的生物膜表现出较强的绿色荧光，表明生物膜具有较高的活力和完整性。在980 nm激光照射下，AIE NP或CM@AIE NP孵育后观察到强烈的红色荧光，表明对生物膜的损伤最大。这一结果证实了CM@AIE NP-based PTT在NIR-II激光照射下能够有效地破坏细菌生物膜，从而增强对细菌感染的抑制作用。
体内中性粒细胞募集
为了评估炎症引发的中性粒细胞向炎症创面的募集，作者用BALB/c小鼠建立了全层皮肤缺损小鼠模型。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测创面组织中3种具有代表性的促炎因子，包括白细胞介素-8 (IL-8)、TNF-α和IL-1β。手术后这些促炎细胞因子的水平更高，这表明手术可以促进促炎细胞因子的产生，有利于炎症介导的CM@AIE NPs精确募集到伤口部位。术后6天创面组织免疫荧光染色分析显示红色荧光较强，进一步证实炎症因子的产生。此外，WB分析进一步证实了手术后炎症细胞因子的产生。
为了探索NPs在体内的精确分布，作者用吲哚菁绿(ICG)标记AIE NPs和CM@AIE NPs (DSPE-PEG-ICG作为脂质体纳米制剂)，并静脉注射到BALB/c小鼠体内。在预测的时间点，通过体内荧光成像评估ICG标记的NPs在伤口部位的积累。与ICG标记的AIE NPs相比，ICG标记的CM@AIE NPs对炎症伤口部位表现出出色的归巢能力，在注射后36小时在伤口部位发出强烈的荧光，在72小时达到最大的积累。这可能是因为CM的涂层可以保护AIE NPs免受小鼠的免疫攻击，因此CM@AIE NPs可以有更长的循环时间并精确地靶向炎症伤口。用牺牲小鼠后定量荧光强度的器官来确认ICG标记的AIE NPs和ICG标记的CM@AIE NPs的分布。
肝脏和肺部的荧光信号水平高于其他组织。收集炎症创面组织，通过显微镜观察ICG标记的NPs的积累情况。强红色荧光也证实，在炎症创面组织中，ICG标记的CM@AIE NPs比ICG标记的AIE NPs分布更多。对创面荧光强度的定量分析发现，更多的ICG标记的CM@AIE NPs在炎症创面聚集，表明CM@AIE NPs在体内具有精确的创面积聚作用和较长的创面滞留时间。
CM@AIE NPs的体内生物相容性评价
为了评价CM@AIE NPs的体内生物安全性，作者用BALB/c小鼠进一步评价其生物相容性。小鼠分别给予PBS、AIE NPs或CM@AIE NPs。取肝、肺、肾、脾、心等主要脏器进行H&E分析。主要脏器未见明显组织病变和炎症细胞，说明CM@AIE NPs治疗后未发生病理性损伤和炎症。血液生化检测通过检测葡萄糖、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、血尿素氮(BUN)、白蛋白和肌酐水平来预测肾脏和肝脏的正常功能。AIE NP组和CM@AIE NP组与PBS组相比，这些参数均无显著差异，说明CM@AIE NP具有较高的生物相容性。
全层皮肤缺损模型的体内创面愈合
在全层皮肤缺损小鼠模型中评估CM@AIE NPs作为潜在抗菌剂的体内伤口愈合性能。选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为代表菌，建立感染BALB/c雌性小鼠模型。将小鼠平均分为PBS、AIE NPs、CM@AIE NPs、AIE NPs +激光、CM@AIE NPs +激光五组(每组5只)。热成像显示，静脉注射CM@AIE NPs后，伤口炎症部位在980 nm激光照射下可快速升温，而注射pbs组温度轻度升高。同时，根据CM@AIE NPs +激光治疗后活鼠的平均体温，伤口区域温度升高24℃，表明CM@AIE NPs产生的高热足以杀死体内细菌。与CM@AIE np组相比，注射AIE NPs组小鼠创面温度升高趋势较慢，这可能与CM对炎症部位的靶向能力较好，免疫逃逸能力较强有关。分别于第1天和第14天记录各组小鼠创面恢复情况和创面距离。CM@AIE NPs +激光治疗促进创面愈合，第14天创面炎症区恢复效果最好。对残余创面面积的定量分析进一步证实，与其他组相比，CM@AIE NPs +激光治疗是促进创面愈合最有效的策略。
此外，细菌集落形成和统计直方图分析结果显示，CM@AIE NPs +激光处理小鼠的组织匀浆中几乎没有细菌存活，这解释了上述结果，验证了CM@AIE NPs在激光照射下的抗菌作用。结果显示，与其他治疗相比，CM@AIE NPs +激光给药可大大减少细菌菌落数量，表明CM@AIE NPs在炎症创面处的体内抗菌性能最好。不同处理后第14天，收集创面皮肤进行H&E和Masson分析，评价创面愈合效果。PBS组皮肤组织切片显示炎症细胞和表皮碎片，代表感染的严重程度。而CM@AIE +激光治疗组组织表皮、毛囊完整，炎症细胞和纤维细胞减少，与正常组织相似，创面愈合效果良好。
值得注意的是，感染可能会损害组织再生并诱导血管损伤，这将成为免疫细胞转移到伤口部位的障碍。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是促进血管内皮细胞增殖和血管生成的典型成员。新生血管是营养物质运输和代谢的基础，是创面愈合过程中组织修复和重建所必需的。CD31作为内皮细胞的标志物，用于评价创面组织新生血管的形成。因此，作者检测了VEGF和CD31的蛋白水平，结果显示CM@AIE NPs +激光治疗显著上调了VEGF和CD31的水平，这表明CM@AIE NPs +激光治疗可以促进创面愈合初期新血管的产生，促进创面血管生成。记录CM@AIE NPs +激光注射后血管密度和直径明显增加，这是由于VEGF和CD31水平升高，促进血管形成。为了进一步探讨CM@AIE NPs +激光治疗加速创面愈合的机制，作者检测了促炎因子的表达，促炎因子可以抑制创面愈合和组织再生，加重组织破坏。CM@AIE +激光治疗后创面组织中IL-1β、TNF-α、IL-8水平明显降低，表明治疗后感染和炎症得到缓解。这些数据表明CM@AIE NP为基础的PTT在体内可以有效抵抗细菌感染，加速伤口愈合。
皮下脓肿模型的体内伤口愈合
此外，耐药菌引起的皮下脓肿情况也威胁着人体健康。因此，作者在皮下脓肿BALB/c小鼠模型中评估CM@AIE NP-based PTT的抗菌效果。首先，将MRSA皮下注射到已消毒的小鼠背部。将感染小鼠均匀分为PBS、AIE NPs、CM@AIE NPs、AIE NPs +激光、CM@AIE NPs +激光五组。热成像和温度曲线显示，CM@AIE NPs +激光治疗组感染区温度在10分钟内从36°C上升到49.6°C，而其他组的温度变化可以忽略不计。在治疗过程中，在预测当天对感染部位进行拍照。PBS组、AIE NP组和CM@AIE NP组感染部位可见大脓疱和红肿。激光照射后脓疱内出现结痂，但感染区域仍肿胀，说明AIE NPs +激光治疗介导的PTT可以杀死MRSA，挽救皮肤感染。然而，CM@AIE NPs +激光治疗14天后结痂和伤口完全愈合，表明CM@AIE np生成的PTT在980 nm激光照射下的抗菌能力最强。
为了进一步量化抗感染治疗效果，在各种处理后第14天采集感染组织进行细菌计数。可以预见的是，CM@AIE NPs +激光治疗后，菌落数量下降到9.4%，这表明CM@AIE NPs -based PTT可以有效地对抗NIR-II激光照射下mrsa诱导的皮肤感染。
为了观察组织学再生的伤口愈合效果，收集新皮肤组织，并在第14天进行H&E和Masson分析。CM@AIE NPs +激光组小鼠真皮组织呈现完整的表皮层，炎症细胞较少，再生毛囊较多。然而，对照组组织显示真皮积液，明显结痂，炎症细胞浸润。马松分析用于评估再生皮肤组织中的胶原沉积和组织(蓝色染色)。CM@ AIE NPs +激光治疗后，脓肿区胶原纤维连续且更明显，提示治疗恢复效果较好。因此，作者可以总结，CM@AIE np生成的PTT可以有效地在体内挽救MRSA感染。考虑到早期炎症在伤口愈合过程中的关键作用，清除污染细菌和创造有利于愈合过程的环境是必不可少的。促炎因子如IL-1β、TNF-α、IL-8在脓肿愈合过程中发挥重要作用;在不同处理后的第14天，测量了它们在脓肿组织匀浆中的水平。结果显示，与其他组相比，CM@AIE NPs +激光治疗在整个愈合过程中可显著降低促炎细胞因子水平至正常健康水平，表明CM@AIE NPs在980 nm激光照射下可有效预防MRSA感染，并大大减轻创面部位的炎症。因此，由于TNF-α、IL-1β和IL-8水平的降低，炎症的减轻可能归因于CM@AIE NPs +激光的抗炎特性。
结论
总之，作者成功开发了一种仿生中性粒细胞样AIE纳米机器人(CM@AIE NPs)，通过产生光热效应，作为一种有效的炎症靶向剂，用于体内抗菌应用。CM@AIE NPs可以有效避免在980 nm激光照射下对周围正常组织造成严重损伤。中性粒细胞膜和AIE NPs通过自组装进一步形成CM@AIE NPs，其结构均匀稳定。基于合适的NIR-II激光器(980 nm, 0。W/cm2)衍生的PTT性能，CM@AIE NPs在体内和体外实验中均表现出优异的抗菌作用。研究发现CM@AIE NPs不仅能在体内精确定位炎症创面，还能调节促炎细胞因子对抗细菌诱导的炎症。此外，CM@AIE NPs +激光治疗上调VEGF和CD31水平，促进血管再生和伤口愈合过程。因此，CM@AIE NPs在不使用抗生素的情况下靶向抗菌性能和促进伤口愈合方面具有优越的潜力，避免了细菌耐药产生的风险，为未来将技术转化为临床应用提供了宝贵的基础。
参考文献
Neutrophil-like Biomimic AIE Nanoparticles with High-Efficiency Inflammatory Cytokine Targeting Enable Precise Photothermal Therapy and Alleviation of Inflammation. Wentao Wang, Yumeng Gao, Ming Zhang, Yuanyuan Li, and Ben Zhong Tang. ACS Nano 2023, 17, 8, 7394–7405. https://doi.org/10.1021/acsnano.2c11762
