内容提要
本文通过用硼二氟吲哚啉（BFI）片段重新工程化吲哚鎓支架来引入模块化的、中性的BF2桥连的花菁（BCy）平台，稳定的光稳定性，发射波长范围为588−837 nm。可调BFI部分能够构建用于质膜的免清洗远红/NIR探针，脂质滴、线粒体和溶酶体以及pH和H2O2响应传感器。这些探针支持高对比度的荧光和STED成像以及活细胞和小鼠肝损伤模型中的动态细胞器跟踪。
结果和讨论
NIR BCy荧光团的合理设计
为了构建一个中性的花菁骨架，我们将硼二氟吲哚啉（BFI）片段引入到多甲川骨架中，用硼配位基序取代传统的吲哚啉的季铵化亚胺，形成BF2桥连的花菁（BCy）。所得的不对称结构破坏了传统花菁的电子对称性，能够通过直接修饰BFI单元来微调分子内电荷转移（ICT）和分子物理行为。
以2，3，3-三甲基吲哚啉为原料，用乙酸酐和三氟化硼乙醚反应合成了BFI。与Fischer醛或其衍生物缩合得到BCy 3 -1和BCy 5 -1。通过将BCy羧酸与碳酸二琥珀酰亚胺酯（DSC）偶联得到反应性酯BCy 3 -2和BCy 5 -2，使得能够进一步官能化。为了进一步调节BFI部分的电子性质并使BCy荧光团官能化，在DMSO催化下，通过N-氯代琥珀酰亚胺（NCS）将氯原子引入到[1，3，2]氧氮杂硼杂环己二烯环上，得到BFI-Cl。 缩合产生氯化类似物BCy 3 -3、BCy 5 -3和BCy 7 -1。
光物理表征显示BCy 3 -1和BCy 5 -1在564/602处显示吸收/发射最大值和660/700 nm。与BCy 3 -1相比，在BCy 5 -1中添加亚乙烯基桥引起了约98 nm的红移。在BCy 3 -2/5-2和BCy 3 -3/5-3中分别引入吸电子酯和Cl取代基，降低了BFI的供电子强度，导致Stokes位移降低和亮度增强。BCy 3 -3和BCy 5 -3获得了优异的亮度（>1.0 × 105 M−1 cm−1），优于常规花菁BCy 7 -1进一步将发射扩展到NIR区域中，具有在837 nm处的峰和窄的斯托克斯位移（λ 20 nm）。与Cy3.5、Cy5.5（或其衍生物NIR 664）和ICG相比，BCy 33、BCy 5 -3和BCy 7 -1分别表现出显著的红移（>20 nm）。
在BCy系列中，发射范围从橙子到具有高亮度的NIR，并且Stokes位移可以通过BFI取代从20调整到107 nm）.大的斯托克斯位移-与传统花菁的典型窄的20 nm范围不同-最小化自重吸收，并且有利于生物成像期间的信噪比优化。依赖性位移进一步证实了所有这些BCy染料的增强的ICT特性。由于疏水性诱导的聚集，它们的发射强度显著减弱。这种行为突出了它们针对细胞疏水环境的适用性，并表明引入亲水基团对于水体系中的特定应用是必要的光稳定性。
免清洗亚细胞生物成像的BCy探针
基于BCy染料的优异光学性质和结构模块性，我们研究了它们在活细胞亚细胞成像中的潜力，与传统的吲哚菁染料相比，BCy染料的一个关键优势是BFI单元可以被各种取代基官能化。这一特征使得能够精确控制细胞器靶向的特异性。将两性离子磺基甜菜碱基团并入BFI片段，产生一系列称为MemBCy的远红外至近红外探针。这些MemBCy探针在宽pH范围（4 - 11）内表现出优异的化学稳定性，并在数小时内对高浓度的硫醇和氧化物质具有抗性。重要的是，MemBCy探针无细胞毒性。
当应用于A549细胞时，所有MemBCy探针都能够实现高对比度质膜成像，而无需洗涤步骤这些染料显示出与已建立的膜标志物Cell Mask绿色和DiO的强共定位，皮尔逊相关系数（PCC）通常超过0.90两亲性MemBCy探针中的BCy荧光团可以锚入质膜，而两性离子磺基甜菜碱基团与膜的外部小叶相互作用。这种双重相互作用机制使有效的膜标记成为可能。延时成像显示了快速的染色动力学：MemBCy 3 -2在1分钟内达到其峰值荧光强度，而MemBCy 5 -1在30分钟达到峰值JemBCy 3 -2能够在染色后长达6小时内实现清晰的PM可视化，而DiO信号在仅1小时后主要是内吞的。值得注意的是，对于MemBCy 3 -2，在低至2nM的染料浓度下实现了有效的膜染色，对于MemBCy 5 -1，在低至20 nM的染料浓度下实现了有效的膜染色，强调了它们的高灵敏度和结合亲和力。
脂滴（Lipid drops，LD）是能量储存和脂质代谢所必需的动态细胞器，在疾病和细胞内稳态中发挥着重要作用。(NIR)由于BCy支架的固有疏水性，我们鉴定了其与LD环境的相容性并开发了四种LD靶向探针：LDBCy 3 -1（也称为BCy 3 -1）、LDBCy 5 -1（也称为BCy 51）、LDBCy 3 -2和LDBCy 5 -2，统称为LDBCy探针。为了评估它们的环境响应性，我们评估了这些染料在非极性溶剂中的光学性能在LDBCy 3 -2和LDBCy 5 -2中引入氯原子导致与它们的非氯化对应物LDBCy 3 -1和LDBCy 5 -1相比在吸收和发射光谱中的显著红移，四种探针在非极性介质中均显示明的荧光，但在水溶液中几乎不发光，这可能是由于聚集诱导的淬灭，这种环境依赖性发射允许在活细胞中具有强信号-背景对比度的免清洗和高度特异性LD成像。用商业LD示踪剂进行的共定位研究产生了超过0.90的PCC值，证实了LDBCy探针的LD靶向特异性。
为了增强BCy平台的效用，我们合成了两种亲水性衍生物，用于通过连接聚（乙二醇）（PEG）链使线粒体和溶酶体成像AitoBCy 5用三苯基鳞部分官能化以用于线粒体靶向，而LysoBCy 5附加有吗啉基团以用于溶酶体特异性。缓冲液中的荧光，并且在无洗涤条件下，显示出与MitoTracker绿色的优异共定位类似地，LysoBCy 5与LysoTracker绿色共定位良好。两种染料都提供了高的细胞器与细胞质对比度。并且线粒体成像实验证实了MitoBCy 5与LDBCy 3 -2对于同时线粒体和LD可视化的相容性。例如，LDBCy 3 -2和MitoBCy 5表现出比它们的商业对应物尼罗红和MitoTracker深红显著更高的抗光漂白性。这种增强的稳定性支持它们在长期成像和强激光激发中的应用。
我们研究了BCy探针用于受激发射耗尽（STED）显微镜的适用性。虽然一些LD靶向探针如LDFG 41已适用于STED，46远红/NIR花菁。为了解决这一空白，使用共聚焦和STED模式对用LDBCy 3 -2和LDBCy 5 -2染色的A549细胞进行成像. STED成像显示了紧密间隔的LD的清晰分辨率，LDBCy 3 -2的液滴间距离低至130 nm。测得的LD半径（190−269 nm）远低于衍射极限，并以高精度分辨。两种LDBCy染料在长时间成像下都保持了优异的性能。LDBCy 3 -2在6分钟后表现出最小的信号损失（<15（100帧）和LDBCy 5 -2持续高质量成像超过250 s（50帧）。此外，当使用单个775 nm耗尽激光器与已建立的STED染料（例如PKMO 37和SiR 47）组合时，LDBCy探针能够实现动态，超过4分钟的线粒体-LD相互作用的双色成像。实时跟踪显示LD接近并重叠于。线粒体，然后分离，表明这些细胞器之间的动态物理相互作用。
基于BCy的H2O2响应探针
为了在真实的时间内观察这种双重效应，我们设计了两个近红外H2O2激活探针HPBCy 5 -1和HPBCy 5 -2，通过将吡啶猝灭剂与BCy 5的BFI片段结合。HPBCy 5 -1和HPBCy 5 -2在722和747 nm处分别显示25倍和13倍的荧光开启响应，表明有效的信号恢复。LC-MS分析证实H2 O2介导的HPBCy 5 -1中硼酸酯的氧化作用，通过比较，Cy 5 -2（在完全离域的π-体系中含有吡啶鎓的对照染料）保持高亮度（Φ = 0.27），这表明有效猝灭在常规花菁中受到限制。
为了评估内源性ROS检测，用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）刺激A549细胞，导致特异性定位于LD的荧光升高。用PMA和油酸共处理的细胞显示出更强的信号。光谱分析证实了线粒体（λ 670 nm）和LD（λ 700 nm）的不同发射谱，从而实现了双色区分。这些结果证明了探针在氧化应激期间追踪H2O2产生和LD形成的独特能力。考虑到氧化应激和肝脂肪变性之间的联系，我们将HPBCy 5 -1应用于对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤小鼠模型。用APAP处理的小鼠显示出显著增强的肝脏荧光，与升高的H2O2水平一致。相反，与N-乙酰半胱氨酸（NAC）共同处理抑制了HPBCy 5 - 1的表达。血液生物化学显示升高的AST和ALT水平，并且H&E染色证实肝损伤。油红0染色和脂质组学分析显示在治疗后4和24小时大量LD积累，其被NAC减轻。这些结果确立了HPBCy 5 -1作为监测肝脏病理中ROS活性和脂质失调的有前景的体内工具。
总结
我们报道了一种通过合理修饰硼二氟吲哚啉（BFI）单元而开发的合成可及的电荷中性的BF 2桥连菁（BCy）支架。与传统的阳离子菁染料不同，BCy染料联合收割机模块可调性，易于合成和中性，有利于快速产生具有定制光学和生物学性质的荧光团。通过修饰BFI片段，我们建立了一个由远红外到近红外荧光团组成的文库，这些荧光团具有高亮度、上级光稳定性，并适合于免清洗和超分辨率成像。支架微调使得能够精确地亚细胞定位到不同的细胞器，包括质膜、脂滴、线粒体，和溶酶体。
参考文献
Reengineering Cyanine Dyes via Borondifluoro Indolenine: A Tunable Platform for Wash-Free Imaging and Responsive Biosensing，Zixuan Zhan, Jifa Zhang, Tianruo Shen, Jie Li, Li Chai, Lili Pan, Haihui Yang, Tianyou Liu,Xiaogang Liu, and Wuyu Mao*，J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 22932，https://doi.org/10.1021/jacs.5c05565.
