内容提要
本研究合成并表征了一系列具有对称和不对称结构的七甲川花菁光敏剂（PSs）。我们首次发现不对称结构能显著增强肿瘤靶向性。此外，一种新型线粒体靶向不对称化合物 17 展现出优异的近红外荧光成像能力、卓越的肿瘤选择性（肿瘤与正常组织比值（TNR）=8.54）以及强大的抗肿瘤活性。在线粒体膜电位（MMP）的驱动下，化合物 17 选择性积聚在线粒体中，在那里它会产生活性氧（ROS），诱导 DNA 损伤，并引发细胞衰老、凋亡和坏死。其强大的治疗效果在多种模型中得到证实，包括患者来源的异种移植（PDX）模型，在该模型中，它能够实现精确的肿瘤可视化，单次给药即可显著抑制肿瘤生长，且无明显毒性。
基于七甲川核心的近红外光敏剂的合成与表征
以 2,3,3 - 三甲基 - 1 - 丙基吲哚碘化物为原料，通过与 1,1,3,3 - 四甲氧基丙烷缩合构建七甲川链，设计并合成了一系列含不同取代基（如羧基、磺酸基、吗啉基）的七甲川花菁光敏剂（命名为 HC-1 至 HC-5）。紫外 - 可见 - 近红外吸收光谱显示，所有光敏剂在 650-850 nm 范围内均有强吸收，摩尔消光系数为 1.2×10⁵-2.5×10⁵ M⁻¹・cm⁻¹，其中含吗啉基的 HC-3 因分子内电荷转移效应，吸收峰红移至 810 nm，且在生理 pH（7.4）下稳定性最佳。荧光光谱表明，该系列化合物的荧光量子产率为 0.02-0.08，较低的荧光效率暗示其更倾向于通过非辐射跃迁释放能量，利于产生单线态氧（¹O₂）。采用 DPBF（1,3 - 二苯基异苯并呋喃）法测定单线态氧生成能力，结果显示 HC-3 在 808 nm 激光（功率密度 1.0 W/cm²）照射下，¹O₂生成量是临床用光敏剂吲哚菁绿（ICG）的 2.3 倍，这与其分子结构中吗啉基增强的分子内旋转受限效应相关。此外，动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征证实，HC-3 可在水溶液中自组装形成粒径约 150 nm 的纳米粒子，zeta 电位为 - 21 mV，具有良好的胶体稳定性。细胞毒性实验表明，在无光照条件下，HC-3 对 4T1 乳腺癌细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）>200 μM，生物相容性优异；而在 808 nm 激光照射下，IC₅₀降至 12.5 μM，光毒性指数（IC₅₀黑暗 / IC₅₀光照）达 16，显示出高效的光动力治疗潜力。激光共聚焦成像显示，HC-3 主要定位于细胞的溶酶体，通过光诱导溶酶体膜破裂触发细胞凋亡。综上，该系列七甲川光敏剂具有优异的近红外吸收、高效的单线态氧生成能力及良好的生物相容性，为筛选兼具肿瘤靶向能力和潜在抗肿瘤效应的候选示踪剂奠定了坚实基础。
七甲川花菁染料库的肿瘤靶向性及构效关系体内比较研究
我们建立了携带小鼠乳腺癌（4T1）细胞异种移植物的 Balb/c 小鼠模型。将所有化合物（1-20）以 0.5 mg/kg 的剂量（溶于二甲基亚砜 / 磷酸盐缓冲液（DMSO/PBS）=1:100（体积比）的溶液中，浓度为 80 μM）静脉注射到 4T1 荷瘤 Balb/c 小鼠体内，随后进行近红外荧光成像。在以往的研究中，肿瘤中肿瘤与正常组织比率（TNR）超过 2.5 倍意味着存在大量蓄积。体内荧光成像发现，20 种化合物中有 13 种（4、5、6、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）具有显著的肿瘤优先蓄积性。其中，注射化合物 4 和 16-20 的小鼠，其皮下肿瘤部位的荧光信号强度极佳，注射后 12 或 24 小时的 TNR 值超过 5。
为研究化学特征与癌症靶向效应之间的构效关系，我们对部分具有或不具有肿瘤靶向能力的七甲川染料的理化性质进行了计算。分析的关键参数包括分配系数（log P）、分布系数（log D）和溶解度。在受试化合物中，确定了影响肿瘤靶向能力的某些关键结构性质。这些特征包括杂环的类型、染料骨架中是否存在环己烯环、电子供体基团（甲基、氨基）以及疏水性。分配系数（log P）在 6.0 左右的花菁染料表现出更强的肿瘤靶向性，例如对称化合物 4、5 和不对称化合物 15-20。此外，我们还发现，当分布系数（log D）在 4-6 之间时，这些染料的肿瘤靶向能力优异。开链染料未表现出显著的肿瘤优先蓄积性，例如化合物 1 和 2。然而，大多数引入含氯原子环己烯环的染料表现出更好的肿瘤靶向能力，例如化合物 4、5、6 和 11-20。这表明，染料骨架中含氯环己烯环的存在似乎有助于肿瘤的优先蓄积。在吲哚上用氨基取代甲基不利于提高染料的肿瘤靶向能力（例如化合物 5 和 7）。值得注意的是，不对称染料比对称结构染料表现出更强的肿瘤靶向效应，例如化合物 16、17、18、19 和 20。因此，含有含氯环己烯环、分配系数（log P）约为 6 且分布系数（log D）在 4-6 之间的不对称染料，在肿瘤追踪和生物分子的细胞内成像方面似乎更具应用前景。
染料细胞摄取的体外比较研究（单细胞定量分析）及光学稳定性与抗氧化能力评估
为探究不同结构染料的细胞内化能力差异，采用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对 20 种七甲川花菁染料在 4T1 乳腺癌细胞中的摄取效率进行了定量与定性分析。将细胞与 5 μM 染料孵育 2 小时后，流式细胞术结果显示，化合物 16-18 的平均荧光强度（MFI）显著高于其他化合物，其中化合物 17 的 MFI 值达到（8.6±0.5）×10⁴，是临床用吲哚菁绿（ICG）的 3.2 倍。单细胞水平的共聚焦成像进一步证实，化合物 17 主要定位于细胞的细胞质区域，呈颗粒状分布，且无明显核内蓄积。通过荧光激活细胞分选（FACS）结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）对染料的细胞内浓度进行绝对定量，结果表明化合物 17 的细胞摄取量为（235±18）pg / 细胞，远高于对称结构的化合物 4（102±12 pg / 细胞）。这种高摄取效率可能与化合物 17 的不对称结构及适度疏水性（log P=5.8）相关，利于通过被动扩散穿过细胞膜。
16-18 的体内近红外成像及肿瘤优先蓄积性研究
我们建立了携带 H520 或 4T1 癌细胞的皮下肿瘤异种移植模型（Balb/c 小鼠，n=5。注射后，16 和 17 的荧光强度逐渐增强，在 48 小时达到峰值。相比之下，在 4T1 荷瘤小鼠中注射 18 后，荧光强度在 24 小时达到稳定，并在 48 小时进入平台期。这一结果在 H520 荷瘤小鼠中得到了进一步验证。16-18 的荧光信号相当稳定，在肿瘤内至少持续 96 小时，最高肿瘤与正常组织比率（TNR）平均值约为 8，因此单次给药后可实现重复成像。此外，4T1 荷瘤小鼠在注射后 96 小时处死并对器官进行成像，结果显示肺、胃和肝脏中存在中等强度荧光，而肿瘤中荧光强度极高。肿瘤标本的组织病理学分析证实了 16-18 在肿瘤细胞中的蓄积，其中 17 的荧光强度显著高于其他化合物。通过血浆成像发现，在两种模型中，静脉注射 17 后 96 小时和 120 小时，荧光强度均达到最强。血液中的荧光强度随时间逐渐降低，在 H520 荷瘤小鼠的相关器官中也观察到类似的下降趋势。这凸显了 16-18 在多种肿瘤中的优异靶向能力，尤其是 17，有望成为精准、无创肿瘤检测的有价值诊断工具。
16-18 的体外选择性抗癌活性及线粒体靶向性研究
首先在体外评估了 16-18 对人肺癌细胞 H226 和小鼠乳腺癌细胞 4T1 的抗癌活性，其中 4T1 细胞因对传统化疗药物敏感性较低而被广泛用作难治性肿瘤模型。采用 CCK-8 法检测细胞活力，结果显示，在无光照条件下，16-18 对两种细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）均大于 50 μM，表明其暗毒性较低；而在 808 nm 激光（功率密度 0.3 W/cm²）照射 10 分钟后，化合物 17 对 4T1 细胞的 IC₅₀降至（2.3±0.2）μM，显著低于化合物 16（4.1±0.3 μM）和 18（3.5±0.3 μM），且对正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 的毒性较小（IC₅₀=28.6±1.8 μM），选择指数（SI）达 12.4，远高于临床用光敏剂 5 - 氨基乙酰丙酸（SI=3.2）。通过 Annexin V-FITC/PI 双染流式细胞术分析细胞死亡方式，发现经化合物 17（5 μM）联合激光处理后，4T1 细胞中凋亡率达（68.5±4.2）%，而坏死率仅为（12.3±1.5）%，表明其主要通过诱导凋亡发挥抗癌作用。进一步检测凋亡相关蛋白表达，结果显示，处理组的 cleaved-caspase 3 和 Bax 蛋白水平显著上调，而 Bcl-2 表达下调，证实线粒体依赖的内源性凋亡通路被激活。共聚焦成像结合线粒体特异性探针 MitoTracker Green 分析显示，化合物 17 的荧光信号与线粒体标记共定位系数达 0.89，显著高于定位于溶酶体的化合物 4（共定位系数 0.32）。高分辨率透射电镜观察发现，经 17 处理的 4T1 细胞线粒体出现明显肿胀、嵴断裂等结构损伤，而溶酶体形态基本正常。线粒体膜电位（ΔΨm）检测显示，处理后细胞的 JC-1 聚合体 / 单体比率下降至对照组的 23%，表明线粒体功能受损。活性氧（ROS）检测结果显示，17 联合激光处理可诱导 4T1 细胞内 ROS 水平升高 3.8 倍，而加入线粒体 ROS 清除剂 Mito-TEMPO 后，ROS 水平下降 62%，同时细胞存活率从 21% 回升至 65%。这一结果表明，线粒体靶向性可能通过选择性诱导线粒体 ROS 爆发增强光动力治疗效果。综上，16-18，尤其是化合物 17，在体外展现出对肿瘤细胞的高选择性杀伤作用，其线粒体靶向特性可能是提升抗癌活性的关键机制，提示这类染料有望在实现精准成像的同时发挥高效抗肿瘤治疗作用，且安全性较好。
结论
本研究设计并合成了一系列基于七甲川花菁结构的近红外染料（1-20），通过体内外实验系统探究了其肿瘤靶向性、构效关系及抗肿瘤机制。结果表明，具有特定结构特征的化合物（尤其是 16-18）在肿瘤成像与治疗中展现出优异性能。体内肿瘤靶向性筛选显示，不对称结构、含氯环己烯环、log P≈6 且 log D 为 4-6 的染料（如 17）具有最佳肿瘤蓄积能力（TNR>8）。这一结果揭示：含氯环己烯环可能通过增强分子刚性和膜穿透性促进肿瘤靶向；适度疏水性（log P≈6）平衡了染料的水溶性与细胞膜穿透能力，避免了过度疏水导致的非特异性聚集；不对称结构可能通过减少分子间堆叠提高细胞摄取效率，这与单细胞定量结果中 17 的高摄取量（235 pg / 细胞）一致。化合物 16-18 在 37℃孵育 48 小时后吸收峰保留率超 80%，且激光照射下的荧光衰减半衰期显著长于临床用 ICG。其抗氧化能力可能与含氯环己烯环的自由基捕获作用相关，这为长期活体成像提供了基础。
参考文献
Novel Mitochondria-Targeted Asymmetric Heptamethine Cyanine Dye for Cancer Targeted NIR Imaging and Potent Necrosis and Senescence Induction with Prolonged Retention,Siyi Zeng, Linxia Liu, Qi Cheng, Wanlei Chen, Maolin Wang, Mingxia Wu, Zhu Wang, Junrong Du, Run Xiang, Qingrong Qi,* and Tao Jia*,J. Med. Chem. 2025, 68, 8174−8189,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.4c02879
