内容摘要
在口腔颌面外科中，皮瓣修复对术后生活质量至关重要。然而，血栓是皮瓣存活的致命伤。此外，一些术后血栓性疾病，如肺栓塞，也会危及患者的生命。传统的诊断方法仍然受到大量硬件的限制，存在不便、延迟和主观性等问题。此外，治疗主要依靠溶栓药物，如尿激酶（UK）纤溶酶原激活剂，可能会造成出血风险，尤其是脑内出血。在此，研究人员开发了一种聚（乳酸-共聚-乙醇酸）纳米颗粒（PLGA），该纳米颗粒含有第一近红外窗口（NIR-I）光热止血剂Y8，以尿激酶纤溶酶原激活剂（UK）为核心，并用纤维蛋白靶向肽Gly-Pro-Arg-Pro-Pro（GPRPP）进行修饰，用于治疗术前和术后血栓栓塞（命名为GPRPP-Y8U@P）。共轭分子 Y8 赋予 GPRPP-Y8U@P 近红外-II 成像能力和出色的光热/光动力治疗效果。体内实验表明，GPRPP-Y8U@P 可通过近红外-II 荧光成像快速定位血栓，对栓塞血管的石蜡切片进行半定量分析，验证了其溶栓功效。此外，束缚在 NPs 中的尿激酶不会导致非特异性出血，极大地提高了物理安全性和治疗效果，并将副作用降至最低。总之，GPRPP-Y8U@P 具有血栓定位准确、血栓消融部位准确、副作用小等优点，证明了这种方法在血栓治疗的有效临床监测方面的吸引力。
结果与讨论
Y8U@P 采用经典的双乳化溶剂蒸发方法制备。使用标准碳二亚胺化学将 GPRPP 肽与 NP 偶联，以获得 GPRPP-Y8U@P（Scheme 1）。透射电子显微镜 (TEM) 和动态光散射 (DLS) 证明纳米粒子的直径约为 220 nm，呈圆形。根据GPRPP的标准曲线，傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实GPRPP成功连接到纳米粒子的表面，负载率为69.67％。通过 BCA Protein Assay Kit， UK 成功加载到 NP 中，加载率为 58.35%，而根据 Y8 在二氯甲烷 (DCM) 中的标准曲线，Y8 加载率为 81.8%。形成NPs后，具有J聚集态的GPRPP-Y8U@P NPs在吸收和发射光谱中表现出红移，使其成为NIR-II成像剂。 Y8的紫外可见（UV-vis）光谱吸收光谱为728 nm，而GPRPP-Y8U@P也显示出红移至788 nm。此外，Y8的荧光发射光谱在812 nm处，GPRPPY8U@P的峰值在约900 nm处观察到，表明GPRPP-Y8U@P能够很好地在NIR-II区域进行红移成像。此外，PBS 中的吸收系数也计算为 8.64。一周内每隔一天监测 GPRPP-Y8U@P 的尺寸和外观，以检查在室温干燥阴凉处的 DMEM 和 ddH2O (pH=5.4, 7, 8.4) 中的储存稳定性，显示出极好的长期稳定性。 GPRPP-Y8U@P的长期储存稳定性。
还研究了药物释放。将溶解在 5 mL PBS 中的 5 mg Y8U@P 暴露于 808 nm 照射（0 或 0.6 w/ cm2）下 2 小时。每 10 分钟用 BCA 试剂盒测量一次上清液。药物释放缓慢，在0 w/cm2照射下2小时后总共获得约60%的累积释放。然而，NIR可以加速它。在0.6 w/cm2下，30 min内可释放50%，最大释放量约为80%。 PLGA 壳的孔径导致在没有 NIR 的情况下缓慢释放。这些结果证明纳米颗粒可以通过近红外暴露实现快速释放以促进溶栓。
GPRPP-Y8U@P的光动力能力如下，通过单线态氧传感器绿（SOSG）在525 nm发射波长下检测激光照射下GPRPP-Y8U@P的单线态氧产量。此外，在激光照射下，发射强度在短短90秒内从2.1显着增加到11.9，这意味着GPRPP-Y8U@P可能是一种具有高单线态氧生成能力的高PDT试剂。单线态氧可以通过灭活一些凝血因子和主要的纤溶抑制剂来抑制凝血并激活纤溶。因此，上述数据支持GPRPP-Y8U@P可以充分发挥光动力抗血栓治疗作用。为了进一步研究GPRPPY8U@P的光热效应，在连续照射后，GPRPP-Y8U@P表现出良好的浓度依赖性（0.25-1 mg/mL）和功率依赖性（0.3-1.2 W/cm2）光热效应， 10分钟内可升高约25℃。我们还按照报道的方法测量了其光热转换效率（约34.58％），比大多数提到的光热剂（<30％）相对较高。
此外，GPRPP-Y8U@P辐照至峰值温度并在室温下冷却十次后，DLS结果和加热-冷却循环曲线没有表现出显着差异。表明GPRPP-Y8U@P具有良好的光热稳定性。由于光热增强血栓穿透、介导纤维蛋白凝块崩解以及 UK 原位精确控制释放，上述数据表明 GPRPPY8U@P 是一种先进的光动力和光热联合治疗平台，用于 PDT/PTT 溶栓治疗。
在不同浓度的体内成像系统下测试了 NIR-II 荧光成像能力，结果显示成像能力具有浓度依赖性。即使在0.125 mg/mL的低浓度下，它仍然具有出色的成像强度。至于组织穿透深度，将0.1 mg/mL GPRPP-Y8U@P放入直径1 mm的毛细管中。十，它们首先被放置在琼脂块下，表现出极好的组织穿透深度。此外，它们还被放置在新鲜鸡胸肉下，计算毛细管的SNR和半峰全宽（FWHM）。即使是6毫米的鸡胸肌，信噪比很高，但在2毫米时最大值为0.627毫米。结果表明，GPRPP-Y8U@P比ICG具有更好的组织穿透深度和信噪比，为体内成像应用奠定了基础。
设计了多种实验模型来探讨GPRPP-Y8U@P与血栓的结合能力。首先，我们验证了GPRPP肽是否可以与纤维蛋白结合。在共聚焦显微镜下，GPRPP-Y8C@P显示出强烈的红色荧光信号强度和纤维蛋白的绿色信号。相比之下，其他两组几乎没有显示红色荧光信号，证明GPRPP对纤维蛋白具有显着的亲和力，并且是血栓靶向剂GPRPP-Y8U@P的基础。在新鲜血凝块靶向实验中也观察到相同的结果：GPRPP-Y8U@P处理的血凝块具有较强的荧光信号，而其他两组则具有较小的信号。结果在红色、白色或旧血栓中重复出现。血栓可分为红色和白色，它们更喜欢在不同的部位形成。我们准备了不同的血栓并验证了GPRPP-Y8U@P也可以针对它们。建立陈旧血栓证明GPRPP-Y8U@P可以对一些易患血栓的慢性患者检测出血栓。这些信息证实GPRPPY8U@P可以靶向多种血栓，具有广阔的临床应用前景。此外，在静态模型中，我们设计了不同的孵育时间，发现GPRPP-Y8U@P仅需5分钟即可实现血栓成像。快速检查血栓的鉴定与文献报道一致。这一结果应归功于GPRPP对纤维蛋白的高亲和力。这可以通过平衡解离常数 (Kd) 来解释：CREKA 的 Kd 为 6 μM，而 GPRPP 的 Kd 约为 8 nM。因此，这些实验不仅证明了GPRPP可以结合纤维蛋白，而且证明了它无疑是一种具有出色靶向能力的血栓靶向剂，这意味着它具有原位溶栓、降低出血风险的基础。
通过治疗后体重减轻率评价体外溶栓能力。将血凝块放入玻璃瓶中进行静态或动态溶栓，并随机分为四组（每组n=3）：UK组、UK+激光组、GPRPPY8U@P组和GPRPP-Y8U@组P+激光组。 GPRPP-Y8U@P的浓度为1mg/mL，而UK的浓度为0.58mg/mL，因为各组中UK的含量相同。无激光组单独孵育30分钟，激光组接受0.6W/cm2照射（808nm）30分钟。处理后，用滤纸小心除去血凝块表面的水分。再次对血块称重，标记为最终重量。然后获得体重减轻率数据来评估溶栓能力，从图我们可以得出结论：（1）GPRPP-Y8U@P的溶栓能力比英国高约24%。 (2)在没有激光的情况下，GPRPP-Y8U@P的溶栓能力较小。我们推测激光会激活溶栓过程。3)PDT/PTT介导的溶栓是可行的。 (4) 流动速度可以解释为什么动态模型溶栓率高于静态模型。
本部分安排了三个测试来评价GPRPP-Y8U@P的血液相容性。首先，血小板粘附是一种统计数据，用于测量 GPRPP-Y8U@P 对血小板的伤害，并通过 LDH 细胞毒性测定试剂盒进行定量。将富含血小板的血浆添加到不含玻璃粉GPRPPY8U@P 的 EP 管中。空管为阴性对照，玻璃组为阳性。 GPRPPY8U@P和玻璃的量均为1mg。当将悬浮液转移到96孔板并通过LDH试剂盒测量时，没有观察到GPRPP-Y8U@P造成明显的损伤。其次，溶血测定提供了测量不同浓度的GPRPP-Y8U@P对红细胞（RBC）造成的损伤的数据。溶血报告为 540 nm 处的吸光度，其中由 PBS 引起的溶血设置为 0%，由 0.1% Triton-100 引起的溶血设置为 100%。数据表明，即使浓度为 1 mg/mL，GPRPP-Y8U@P 对红细胞也没有明显损害。第三，将添加氯化钙后进行不同处理的每组的纤维出现时间确定为血浆再钙化时间(PRT)。 PRT可用于计算GPRPP-Y8U@P是否可以激活内在凝血途径。幸运的是，再次发现轻微损坏。综合以上结果，我们认为GPRPP-Y8U@P在血液中使用是安全的，不会发生凝血。
接下来，我们通过三种方法（CCK-8检测、Calcein-AM/PI双重染色试剂盒和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒）在两种条件下（简单的共孵育或激光共孵育）。首先，活/死染色（Calcein-AM/PI 双染色试剂盒），表明这些组中几乎没有红色信号。这些结果通过流式细胞术（FCM）重复。 Q4中活细胞的定量分析也显示出良好的细胞相容性。而且，CCK-8测量的实验组细胞活力仍然>90%。实验组（简单共孵育或激光共孵育）的数据与PBS组相似，因此我们得出结论，GPRPP-Y8U@P几乎不会导致细胞死亡并抑制细胞增殖。尽管在温和的激光刺激下，细胞活力与 PBS 组相似。
在 Raw264.7（小鼠单核细胞/巨噬细胞系）中观察到相同的结果。综上所述，GPRPPY8U@P引起的细胞毒性很小，表明GPRPP-Y8U@P对正常细胞具有极好的细胞相容性。这些结果为后续体内血栓靶向治疗实验奠定了必要的基础。
上述实验证明了GPRPP-Y8U@P的基本生物安全性，并在大鼠中进行了功能验证。首先，我们根据 Virchow 血栓形成的基本机制建立皮瓣和一般血栓模型。成像能力首先在血管成像中得到研究。耳内直径小于1毫米的细小血管清晰可见。肠系膜动脉、McFarlane瓣、腹部皮瓣血管清晰可见。睾丸的瘘管清晰可见，甚至被腹壁肌肉覆盖，表明GPRPP-Y8U@具有良好的组织穿透性P。
之后我们还研究了血栓监测能力。局部应用饱和5%氯化铁的滤纸诱导血栓形成后，血栓区域显示“荧光熄灭”，呈暗区。血栓一诱发，“荧光就熄灭”，这预示着血栓成像研究的新纪元和巨大的临床应用潜力。 GPRPPY8U@P+激光治疗后，血管再通也通过“荧光再通”反映出来。同样，在McFarlane和腹部皮瓣血管中也检测到血栓。所有数据证明5分钟内即可诊断出血栓，与体外靶向结果一致，优于文献报道的大多数血栓显像剂。快速诊断可能是由于 GPRPP 与纤维蛋白的亲和力远高于 CREKA。此外，还可以监测血管再通情况，满足临床需求。我们认为颗粒只结合在血栓表面，通向血栓的血管中的强信号是通过“荧光熄灭”而不是“点亮”暴露出来的。
测定两组（UK+激光组和GPRPP-Y8U@P组）的溶栓效果。对于 UK+激光组，UK (0.58 mg/40 g) 通过尾静脉注射进行递送。 10根栓塞血管接受808 nm激光照射（0.6 w/cm2）60分钟。对于肺栓塞动物模型，激光功率增加至1w/cm2，照射区域为肺体表投影。 GPRPP-Y8U@P组大鼠接受1 mg/40 g（相当于0.58 mg/40 g UK）GPRPP-Y8U@P，激光与UK+激光组相同。治疗结束后，立即处死大鼠，取出相关血管和肺进行组织学检查。采用栓塞率评价各组疗效，栓塞率计算如下：
1. 大腿前外侧血栓栓塞：残余血栓率=（栓塞面积/血管总面积）×100%
2. 肺栓塞：100×视野下随机，栓塞率=（栓塞血管数/所有血管数）×100%
最后我们发现，在肺栓塞组中，UK+激光组的栓塞率比GPRPP高约40% -Y8U@P+激光组。此外，大腿前外侧fap模型的平均发生率高出近60%。与单独UK相比，联合PDT和PTT后溶栓效率（包括溶栓时间和残余血栓）显着提高。60分钟内血栓可减少约50%，满足了大多数血栓事件改善血流动力学的迫切需要。特别是，这些结果是在相对较低的激光功率下获得的，从而提高了生物安全性。简而言之，我们在本节中出色地证明了 GPRPP-Y8U@P 的血栓成像能力和溶栓有效性。我们相信GPRPPY8U@P能够显着实现血栓靶向治疗，具有快速诊断和血管再通能力。
体内生物安全性评估如图所示。首先，KM小鼠接受PBS（100 μL）或GPRPP-Y8U@P（1mg/mL，100 μL）的注射。记录一周的体重变化，没有显着差异。之后，剪尾进行尾部出血测定，测量出血时间和出血量，与对照组相比均在正常范围内。然后将小鼠安乐死，采集血液进行血常规和生化分析。根据这些指标，确定了GPRPP-Y8U@P的生物安全性。最后，福尔马林固定石蜡包埋组织切片后，采用主要脏器HE切片进行安全性评估。 HE切片未观察到器官组织损伤。上述数据分析充分证明，至少在整个实验期间，没有观察到GPRPP-Y8U@P引起的体征或毒性。还通过HE切片评估并进行了皮肤和肌肉致敏测定。每只小鼠背部一侧皮下注射PBS，腿部肌肉注射PBS。然后另一侧注射GPRPP-Y8U@P进行自我控制。连续三天后，切除注射部位的皮肤和肌肉进行HE染色。没有再次表现出组织损伤的迹象。总之，生物安全评估未发现行为、体重减轻或中毒异常。GPRPP-Y8U@P具有良好的组织相容性，可作为血栓靶向治疗材料。
收集大鼠的器官和血液来测量GPRPP-Y8U@P发出的光强度。颗粒主要存在于肝脏和脾脏中。肝脏中 5 天、脾脏中 8 小时后，几乎所有颗粒都被清除。网状内皮系统过滤颗粒，导致颗粒主要存在于肝脏和脾脏中。此外，血液中的强度可在近24小时内保持显着。数据表明，GPRPP-Y8U@P 具有满足临床需求的潜力，因为其周期时间涵盖了手术和术后第一晚。
结论
总之，开发了一种用于纤维蛋白靶向和抗血栓治疗的血栓集成纳米药物 GPRPP-Y8U@P。我们首先专注于皮瓣血栓靶向治疗，取得了良好的疗效。基于GPRPP的纤维蛋白靶向能力和Y8纳米粒子的NIR-II成像效果，GPRPP-Y8U@P可以直观地立即定位血栓区域。在血栓动物模型上完成 NIR-II 成像引导的 UK/PDT/PTT 治疗，以在 NIR 激光照射下消除血栓。 GPRPPY8U@P 溶栓效果高且出血风险低，说明了 GPRPPY8U@P 用于血栓治疗的适当性。因此，我们的工作首次实现了皮瓣可视化监测，并首次关注皮瓣原位溶栓。总体而言，我们目前对 GPRPPY8U@P 精心设计的原理和血栓治疗的工作是抗血栓治疗和皮瓣抢救的有效策略。未来的深入研究可能会显着提高皮瓣和血栓的监测效率。
参考文献
Thrombus-targeted nano-agents for NIR-II diagnostic fluorescence imaging-guided flap thromboembolism multi-model therapy. Zichen Cao, Xinyu Zhang1, Zheng Wei, Chuanhui Song , Huihui Zou , Jianchuan Ran , Hongbo Zhang , Diya Xie , Shengwei Han , Yufeng Wang , Yu Cai* and Wei Han， J Nanobiotechnol 20, 447 (2022). https://doi.org/10.1186/s12951-022-01649-6
